使用CIRCexplorer2识别环状RNA
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CIRCexplorer是一款环状RNA预测软件，专门用于预测exonic circRNA，网址如下
https://github.com/YangLab/CIRCexplorer2
环状RNA的识别包含了序列比对和环状RNA预测两步，该软件目前更新到了v2版本，相比v1版本，用法有较大变化。在v1版本中只支持tophat-fusion和STAR两款软件进行序列比对来识别junction reads,在v2版本中，扩展到了以下5种软件
- Tophat-Fusion
- STAR
- BWA
- MapSplice
- segemehl
v1版本中所有命令封装在一个脚本中，v2版本也进行了改进，同时提供了单脚本一键化运行和分模块运行两种方式，保证了软件使用的简便性和灵活性。
该软件的安装相对而言，略显复杂，因为依赖的软件特别多，这里我直接把我在docker进行中的安装命令贴上来，供大家参考
docker run -it centos
yum install -y epel-release
yum install -y gcc gcc-c++ make zlib zlib-devel bzip2 bzip2-devel python2 python2-pip python-devel xz xz-devel unzip which ncurses-devel ncurses
# CIRCexplorer2
pip install circexplorer2
# tophat & tophat-fusion
wget http://ccb.jhu.edu/software/tophat/downloads/tophat-2.1.1.Linux_x86_64.tar.gz
tar xvzf tophat-2.1.1.Linux_x86_64.tar.gz
cd tophat-2.1.1.Linux_x86_64
cp b* c* f* g* j* long_spanning_reads map2gtf prep_reads sam* segment_juncs sra_to_solid tophat* /usr/local/bin/
# cufflinks
wget http://cole-trapnell-lab.github.io/cufflinks/assets/downloads/cufflinks-2.2.1.Linux_x86_64.tar.gz
tar xzvf cufflinks-2.2.1.Linux_x86_64.tar.gz
cp * /usr/local/bin/
# bedtools
wget https://github.com/arq5x/bedtools2/releases/download/v2.25.0/bedtools-2.25.0.tar.gz
tar -zxvf bedtools-2.25.0.tar.gz
cd bedtools2
make
cd bin
cp * /usr/local/bin/
# UCSC
wget http://hgdownload.soe.ucsc.edu/admin/exe/linux.x86_64/genePredToGtf
wget http://hgdownload.soe.ucsc.edu/admin/exe/linux.x86_64/gtfToGenePred
wget http://hgdownload.soe.ucsc.edu/admin/exe/linux.x86_64/bedGraphToBigWig
wget http://hgdownload.soe.ucsc.edu/admin/exe/linux.x86_64/bedToBigBed
chmod +x bedGraphToBigWig bedToBigBed genePredToGtf gtfToGenePred
mv bedGraphToBigWig bedToBigBed genePredToGtf gtfToGenePred /usr/local/bin/
# star
wget https://github.com/alexdobin/STAR/archive/2.7.0d.tar.gz
tar xzvf 2.7.0d.tar.gz
cd STAR-2.7.0d/bin
cd Linux_x86_64_static
cp * /usr/local/bin/
# bwa
wget https://sourceforge.net/projects/bio-bwa/files/bwa-0.7.17.tar.bz2
tar xjvf bwa-0.7.17.tar.bz2
cd bwa-0.7.17
make
cp bwa /usr/local/bin/
# mapsplice
wget http://protocols.netlab.uky.edu/~zeng/MapSplice-v2.1.7.zip
unzip MapSplice-v2.1.7.zip
cd MapSplice-v2.1.7
make
# segemehl
wget https://github.com/samtools/htslib/releases/download/1.9/htslib-1.9.tar.bz2
tar xjvf htslib-1.9.tar.bz2
cd htslib-1.9
./configure
make
make install
wget http://www.bioinf.uni-leipzig.de/Software/segemehl/downloads/segemehl-0.3.4.tar.gz
tar xzvf segemehl-0.3.4.tar.gz
cd segemehl-0.3.4
export PKG_CONFIG_PATH=/usr/local/lib/pkgconfig/:$PKG_CONFIG_PATH
make
cp segemehl.x /usr/local/bin/相比安装，软件的使用过程就显得简单多了，该软件分为以下5个功能模块
- Align
- Parse
- Annotate
- Assemble
- Denovo
Align用于将序列比对到参考基因组上;Parse用于从比对结果中挑选junction reads;Annotate用于预测环状RNA;Assemble用于组装环状RNA的转录本序列；Denovo根据序列组装结果，识别新的环状RNA和分析环状RNA上的可变剪切事件。具体用法如下
1. Align
虽然支持多款序列比对软件，但是由于tophat的结果更方便后续的cufflinks软件进行分析，官方推荐使用tophat来进行比对。针对单端序列的比对，代码如下
CIRCexplorer2 align \
-G hg19.gtf \
-i bowtie1_index \
-j bowtie2_index \
-f RNA_seq.fastq \
> CIRCexplorer2_align.log值得注意的是，align模块仅提供了针对单端序列使用tophat进行比对的功能，如果你是双端测序的结果或者想要使用其他软件，只能是自己手工进行比对，这里比较推荐STAR软件，速度较快，缺点就是内存消耗较大。
2. parse
parse用于解析序列比对的结果，支持多款软件，以常用的STAR为例，代码如下
CIRCexplorer2 parse \
-t STAR \
Chimeric.out.junction \
> CIRCexplorer2_parse.log对于其他软件的用法，具体请参考官方文档，无论是什么比对软件，该命令最终都会生成以下文件
back_spliced_junction.bed
3. annotation
这一步就是根据已知的线性转录本信息，识别环状RNA，所以需要提供参考基因组对应的注释文件，官方也提供了脚本来帮助我们下载，用法如下
fetch_ucsc.py hg19 ref hg19_ref.txt预测环状RNA的代码如下
CIRCexplorer2 annotate \
-r hg19_ref.txt \
-g hg19.fa \
-b back_spliced_junction.bed \
-o circularRNA_known.txt \
> CIRCexplorer2_annotate.log-o参数为输出结果，内容示意如下
每列的含义如下所示
由于后续的两个模块只能处理tophat的结果，我用的是STAR测试的，所以这里就不描述其用法了。
如果你只是想要使用这个软件来预测环状RNA,那么多款序列比对软件都可以选择，但是你想要使用完整功能，则必须使用tophat来进行比对。
·end·
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