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使用CIRCexplorer2识别环状RNA

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CIRCexplorer是一款环状RNA预测软件,专门用于预测exonic circRNA,网址如下

https://github.com/YangLab/CIRCexplorer2

环状RNA的识别包含了序列比对和环状RNA预测两步,该软件目前更新到了v2版本,相比v1版本,用法有较大变化。在v1版本中只支持tophat-fusion和STAR两款软件进行序列比对来识别junction reads,在v2版本中,扩展到了以下5种软件

  1. Tophat-Fusion
  2. STAR
  3. BWA
  4. MapSplice
  5. segemehl

v1版本中所有命令封装在一个脚本中,v2版本也进行了改进,同时提供了单脚本一键化运行和分模块运行两种方式,保证了软件使用的简便性和灵活性。

该软件的安装相对而言,略显复杂,因为依赖的软件特别多,这里我直接把我在docker进行中的安装命令贴上来,供大家参考

docker run -it centos
yum install -y epel-release
yum install -y gcc gcc-c++  make zlib zlib-devel bzip2 bzip2-devel python2 python2-pip python-devel xz xz-devel unzip which ncurses-devel ncurses
# CIRCexplorer2
pip install circexplorer2
# tophat & tophat-fusion
wget http://ccb.jhu.edu/software/tophat/downloads/tophat-2.1.1.Linux_x86_64.tar.gz
tar xvzf tophat-2.1.1.Linux_x86_64.tar.gz
cd tophat-2.1.1.Linux_x86_64
cp b* c* f* g* j* long_spanning_reads map2gtf prep_reads sam* segment_juncs sra_to_solid tophat* /usr/local/bin/
# cufflinks
wget http://cole-trapnell-lab.github.io/cufflinks/assets/downloads/cufflinks-2.2.1.Linux_x86_64.tar.gz
tar xzvf cufflinks-2.2.1.Linux_x86_64.tar.gz
cp * /usr/local/bin/
# bedtools
wget https://github.com/arq5x/bedtools2/releases/download/v2.25.0/bedtools-2.25.0.tar.gz
tar -zxvf bedtools-2.25.0.tar.gz
cd bedtools2
make
cd bin
cp * /usr/local/bin/
# UCSC
wget http://hgdownload.soe.ucsc.edu/admin/exe/linux.x86_64/genePredToGtf
wget http://hgdownload.soe.ucsc.edu/admin/exe/linux.x86_64/gtfToGenePred
wget http://hgdownload.soe.ucsc.edu/admin/exe/linux.x86_64/bedGraphToBigWig
wget http://hgdownload.soe.ucsc.edu/admin/exe/linux.x86_64/bedToBigBed
chmod +x bedGraphToBigWig bedToBigBed genePredToGtf gtfToGenePred
mv  bedGraphToBigWig bedToBigBed genePredToGtf gtfToGenePred /usr/local/bin/
# star
wget https://github.com/alexdobin/STAR/archive/2.7.0d.tar.gz
tar xzvf  2.7.0d.tar.gz
cd STAR-2.7.0d/bin
cd Linux_x86_64_static
cp * /usr/local/bin/
# bwa
wget https://sourceforge.net/projects/bio-bwa/files/bwa-0.7.17.tar.bz2
tar xjvf bwa-0.7.17.tar.bz2
cd bwa-0.7.17
make
cp bwa /usr/local/bin/
# mapsplice
wget http://protocols.netlab.uky.edu/~zeng/MapSplice-v2.1.7.zip
unzip MapSplice-v2.1.7.zip
cd MapSplice-v2.1.7
make
# segemehl
wget https://github.com/samtools/htslib/releases/download/1.9/htslib-1.9.tar.bz2
tar xjvf htslib-1.9.tar.bz2
cd htslib-1.9
./configure
make
make install
wget http://www.bioinf.uni-leipzig.de/Software/segemehl/downloads/segemehl-0.3.4.tar.gz
tar xzvf segemehl-0.3.4.tar.gz
cd segemehl-0.3.4
export PKG_CONFIG_PATH=/usr/local/lib/pkgconfig/:$PKG_CONFIG_PATH
make
cp segemehl.x  /usr/local/bin/

相比安装,软件的使用过程就显得简单多了,该软件分为以下5个功能模块

  1. Align
  2. Parse
  3. Annotate
  4. Assemble
  5. Denovo

Align用于将序列比对到参考基因组上;Parse用于从比对结果中挑选junction reads;Annotate用于预测环状RNA;Assemble用于组装环状RNA的转录本序列;Denovo根据序列组装结果,识别新的环状RNA和分析环状RNA上的可变剪切事件。具体用法如下

1. Align

虽然支持多款序列比对软件,但是由于tophat的结果更方便后续的cufflinks软件进行分析,官方推荐使用tophat来进行比对。针对单端序列的比对,代码如下

CIRCexplorer2 align \
-G hg19.gtf \
-i bowtie1_index \
-j bowtie2_index \
-f RNA_seq.fastq \
> CIRCexplorer2_align.log

值得注意的是,align模块仅提供了针对单端序列使用tophat进行比对的功能,如果你是双端测序的结果或者想要使用其他软件,只能是自己手工进行比对,这里比较推荐STAR软件,速度较快,缺点就是内存消耗较大。

2. parse

parse用于解析序列比对的结果,支持多款软件,以常用的STAR为例,代码如下

CIRCexplorer2 parse \
-t STAR \
Chimeric.out.junction \
> CIRCexplorer2_parse.log

对于其他软件的用法,具体请参考官方文档,无论是什么比对软件,该命令最终都会生成以下文件

back_spliced_junction.bed

3. annotation

这一步就是根据已知的线性转录本信息,识别环状RNA,所以需要提供参考基因组对应的注释文件,官方也提供了脚本来帮助我们下载,用法如下

fetch_ucsc.py hg19 ref hg19_ref.txt

预测环状RNA的代码如下

CIRCexplorer2 annotate \
-r hg19_ref.txt \
-g hg19.fa \
-b back_spliced_junction.bed \
-o circularRNA_known.txt \
> CIRCexplorer2_annotate.log

-o参数为输出结果,内容示意如下

每列的含义如下所示

由于后续的两个模块只能处理tophat的结果,我用的是STAR测试的,所以这里就不描述其用法了。

如果你只是想要使用这个软件来预测环状RNA,那么多款序列比对软件都可以选择,但是你想要使用完整功能,则必须使用tophat来进行比对。

·end·

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本文分享自微信公众号 - 生信修炼手册(gh_0146e37a8a70),作者:lzyg

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原始发表时间:2019-02-21

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