chip_seq质量评估之查看抗体富集效果

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chip_seq通过抗体来富集基因组上的部分区域，抗体富集的效果直接绝对了实验的成败, 借助deeptools中的plotFringerprint命令，可以有效评估和查看抗体富集效果。

其核心原理就是累计分布函数，首先将基因组区域划分成等长的区间也称之为bin, 计算每个区间内coverage的比例，然后按照比例大小从第到高排序，依次将不同bin的coverage进行累加，绘制累计分布曲线。

对于input样本，理论上来讲reads在基因组上均匀分布的，不存在任何区域的富集，所以其累计分布曲线如下所示

上图代表一个在-1到1之间的均匀分布，左侧是其分布曲线，右侧是累计分布曲线，可以看到是一条对角线。

对于抗体处理的样本，由于只富集到基因组部分区域，所以其reads肯定不是均匀分布，累计分布曲线肯定是偏离对角线的。那么一个好的抗体处理结果应该是什么样子呢，在deeptools的官网上给了示例

上图是一个H3K4me3组蛋白修饰的chip_seq结果，对于input样本，其累计分布曲线接近于对角线，之所以存在一定程度的偏离，是因为文库构建过程中并不是完全随机的，所以input样本也存在了一些富集区域，这些区域就是peak caling过程中的背景；还有一个注意的是，横坐标的起始位置部位0，这代表了基因组的覆盖度，理论上来讲应该是100%的覆盖度，就是基因组所有区域都能检测到对应的reads,但是在实际情况中，会存在部分区域检测不到的情况，借助横坐标的起始位置可以判断出基因组的覆盖度。

对于抗体处理的样本，由于其在基因组上部分区域富集，只需要富集区域对应的少数几个bin累加占比就特别高，在这种fingerprint图上横坐标越大对应bin富集的reads越多,而纵坐标代表累加的reads所占比例。以上图为例，黑色点对应的横坐标为0.97， 纵坐标为0.55， 这说明97%的基因组区域对应的reads占比只有55%， 剩下的3%区域的reads占比高达45%, 这些3%的区域就可以看到富集的区域，所以上图中抗体的富集效果是显著的。

一个富集效果不显著的例子如下

input和抗体处理的样本累计分布曲线的趋势接近，在抗体处理样本的累计分布曲线中并没有观测到一个突出来的点。具体用法示意如下

plotFingerprint \
-b testFiles/*bam \
--labels H3K27me3 H3K4me1 H3K4me3 H3K9me3 input \
--minMappingQuality 30 \
--skipZeros \
--region 19 \
--numberOfSamples 50000 \
-T "Fingerprints of different samples"  \
--plotFile fingerprints.png \
--outRawCounts fingerprints.tab

输入文件为比对参考基因组产生的bam文件，输出结果示意如下

突出的点越靠近右下方，说明基因组上富集区域的占比越小。通过这种fingerprint图，不仅可以对抗体富集效果有一个相对直观的评估，还可以看出为覆盖到的基因组比例以及富集区域的比例。

·end·

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