都2020年了你还在用tophat吗（RNA-seq数据免费分析）

生信技能树

发布于 2020-02-20 15:13:39

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发布于 2020-02-20 15:13:39

文章被收录于专栏：生信技能树

五年前我在生信菜鸟团博客写过一个《RNA-seq流程需要进化啦》，上面分享过：

Tophat 首次被发表已经是6年前 Cufflinks也是五年前的事情了 Star的比对速度是tophat的50倍，hisat更是star的1.2倍。 stringTie的组装速度是cufflinks的25倍，但是内存消耗却不到其一半。 Ballgown在差异分析方面比cuffdiff更高的特异性及准确性，且时间消耗不到cuffdiff的千分之一 Bowtie2+eXpress做质量控制优于tophat2+cufflinks和bowtie2+RSEM Sailfish更是跳过了比对的步骤，直接进行kmer计数来做QC，特异性及准确性都还行，但是速度提高了25倍 kallisto同样不需要比对，速度比sailfish还要提高5倍！！！

如果你现在（2020）做人类数据分析，比如lncRNA的鉴定啥的，当然是走hisat2+stringTie流程啦，取代已经十多年了的tophat+Cufflinks流程。但是我这两天假期无聊刷文献，看到发表在Theranostics 2020,的研究文章：Long noncoding RNA PiHL regulates p53 protein stability through GRWD1/RPL11/MDM2 axis in colorectal cancer里面的RNA-seq数据居然还是在走十几年前的tophat流程哦，有趣，而且写的不清不楚那个FPKM是如何计算的。在广州锐博公司？

实际上，RNA-seq我们在生信技能树应该是至少推出了400篇教程，而且是我们全国巡讲的标准品知识点，其中还有一个阅读量过两万的综述翻译及其细节知识点的补充：

相信大家听完了我B站的RNA-seq分析流程后，对这个数据的应用方向都不陌生。代码也很简单，如果你有Linux基础，基本上一两个小时就可以完成数据分析流程，拿到表达矩阵啦。就是：

# 安装RNA-seq数据处理流程
# 代码参考：https://www.jianshu.com/p/a84cd44bac67
# 视频教程见：https://www.bilibili.com/video/av28453557

hisat2=/home/jianmingzeng/biosoft/HISAT/hisat2-2.0.4/hisat2
# # 如果使用conda安装的 hisat2，那么 hisat2 命令应该是在环境变量的。
## 索引文件需要自己下载
# https://ccb.jhu.edu/software/hisat2/manual.shtml
# wget ftp://ftp.ccb.jhu.edu/pub/infphilo/hisat2/data/mm10.tar.gz

index=/home/jianmingzeng/reference/index/hisat/mm10/genome
ls raw_fq/*gz |  while read id; do 
$hisat2 -p 10 -x $index -U $id  -S ${id%%.*}.hisat.sam
done 

ls *.sam|while read id ;do (samtools sort -O bam -@ 5  -o $(basename ${id} ".sam").bam   ${id});done
rm *.sam 
ls *.bam |xargs -i samtools index {}

## gtf文件推荐去gencode数据库下载
gtf=/home/jianmingzeng/reference/gtf/gencode/gencode.vM12.annotation.gtf
featureCounts=/home/jianmingzeng/biosoft/featureCounts/subread-1.5.3-Linux-x86_64/bin/featureCounts   
# # # 如果使用conda安装的 subread，那么featureCounts  命令应该是在环境变量的。
$featureCounts -T 5 -p -t exon -g gene_id  -a $gtf -o  all.id.txt  *.bam  1>counts.id.log 2>&1 &

这篇文章其实并没有怎么使用这个RNA-seq数据，可能是因为确实他们课题组并不懂测序数据，也没有生物信息学基础知识背景吧。就是委托公司简单测序而已。