ANESTHESIOLOGY脑电研究 :全麻手术患者的大脑动态连接
ANESTHESIOLOGY脑电研究 :全麻手术患者的大脑动态连接
皮层功能连接对于研究意识和麻醉非常重要，但是手术和麻醉过程中的功能连接模式是未知的。本研究假设手术麻醉会破坏连接模式。
方法：
招募53名外科病人作为被试。围手术期采集EEG数据。功能连接的指标为wPLI(weighted phase lag index，加权相位延迟指数)。麻醉维持过程中，通过马尔可夫链分析对连接状态的时间动力学进行表征，并对状态转换概率进行了量化。
结果：
与预充氧基线相比，麻醉维持过程和围手术期aplha频段的额叶-顶叶连接无显著差异。而在麻醉维持期间，alpha频段的前额叶-额叶连接、theta频段的前额叶-额叶连接以及theta频段的额叶-顶叶连接显著增强。
结论：
手术期和全身麻醉期的功能连接模式动态变化，但这种变化是以结构化的方式进行的。因此，单一的功能连接可能并不适用于手术麻醉。本文发表在ANESTHESIOLOGY杂志。
研究背景
手术患者从注射麻醉药物开始到大脑失去意识，再到手术结束，大脑皮层之间是如何动态连接的，这是研究者一直探讨的问题。因为麻醉过程中，大脑皮层的功能连接对于判别大脑的意识状态非常重要，但手术全麻过程中的功能连接模式尚不清楚。
有研究者证明大脑皮层连接模式的转移或者中断与手术麻醉是有一定关系的，但是与其他的身体器官系统不同，在整个围手术期，大脑没有表现出关于连接模式转移或者中断的标准度量值。（注：围手术期是围绕手术的一个全过程，从病人决定接受手术治疗开始，到手术治疗直至基本康复，包含手术前、手术中及手术后的一段时间，具体是指从确定手术治疗时起，直到与这次手术有关的治疗基本结束为止，时间约在术前5-7天至术后7-12天）
目前，在研究大脑皮层的动态连接时，有一种方法是将注射了特定麻醉药物而采集到的脑电信号与唤醒状态的神经回路机制联系起来进行比较。另一种方法是收集多个特定状态的信号，来反映不同意识状态下的神经机制。研究结果表明皮层连接已经可以被用来区别意识清楚状态和全麻状态。还有实验结果也表明额叶至顶叶的连接指标也可以反映因为麻醉剂而导致的意识不清。
但是还存在一些问题。首先，还不清楚是否可以在围手术期以实际一点的方式获得不同皮层之间的功能连接。第二，还不知道这种连接能否在临床环境中成功地识别出唤醒状态。第三，在动物研究中发现皮层震荡在麻醉过程中会动态转移。
因此，本研究的主要目的是评估围手术期的大脑皮层连接模式。研究者的假设是：额叶和顶叶之间的功能连接在麻醉过程中会受到抑制，在麻醉失效后增强。第二个目的是评估麻醉维持阶段功能连接的动态变化。麻醉维持阶段定义为最小肺泡浓度（MAC）大于或等于0.7的时期。（注：在一个大气压下，能使50%的病人失去痛觉的肺泡气体中全麻药的浓度被称为最小肺泡浓度（minimal alveolar concentration, MAC），各种吸入性麻醉药都有恒定的MAC值，数值越低，该药的麻醉作用越强。）
材料和方法
研究人群
53名需要全麻手术的成年患者（18岁及18岁以上），所有患者均接受丙泊酚导入的全身麻醉，并且根据所选的麻醉药物方案（通常采用多种药物）维持全身麻醉。
脑电采集和分析
使用16导的脑电帽（Cognionics Inc）以500HZ的采样率记录脑电信号，在线参考电极为双侧乳突。原始脑电信号被导出到MATLAB（2017a版），并降采样至250Hz。首先研究在围手术期，不同意识状态的皮层振荡和皮层连接的变化。其次在麻醉持续阶段，观察皮层连接模式是静态变化还是动态变化的。
时间周期的选择和预处理
如图1所示，在整个围手术期选择9段与临床相关的脑电信号。
图1代表整个围手术期。蓝色方块代表提取脑电图数据的时间段。LOC，失去知觉的时间点；PACU，麻醉后的护理部分；skin Incision:皮肤切口；手术周期1，手术完成25％时的脑电数据；手术周期2，手术完成50％时的脑电数据；手术周期3，手术完成75％时的脑电数据。
选择这9个周期的标准
1）尽可能选择接近每个临床事件的脑电数据；2）在每个脑区至少有一个可用导联（前额叶：Fp1，Fp2；额叶：F5，F6，Fz；顶叶：P5，P6，Pz）。这些导联的位置如下图所示。
在注射麻醉剂或者吸入麻醉气体后，研究员指示被试闭上眼睛。然后，要求被试在呼吸肌麻痹之前按压研究员的手，以便研究员可以通过该行为判断被试是否已经失去了意识。选择预充氧前3分钟的时间窗和充氧后6分钟的时间窗，然后选择麻醉后护理部分2分钟内的脑电数据，通常闭眼后采集的数据发生在在麻醉后24.7（±11.6）分钟。选择到的9个周期分别是：
①预充氧后30s–60 s（预充氧是指在病人意识消失和呼吸肌麻痹之前的几分钟，吸入纯氧能显著延长呼吸停止到出现低氧血症的时间，这是麻醉诱导和插管前不可省略的部分）;
②失去意识后1分钟；
③皮肤切开前1分钟;
④完成手术25%后的1分钟
⑤完成手术50%后的1分钟
⑥完成手术75%后的1分钟
⑦拔管三分钟内的一分钟；
⑧拔管后6分钟内的1分钟；
⑨麻醉术后护理部分30–60s。（麻醉后护理部分：当病人的自主呼吸恢复良好，意识完全清醒，辩知能力良好，生命体征平稳时，即达到了麻醉苏醒离室标准，便可以返回病房了。）
脑电预处理
脑电信号按照以下步骤进行预处理。
1）通过肉眼检查去除带有明显伪迹的问题导联。
2）在Chronux工具箱使用局部线性回归方法以10s窗长，5s步长对信号进行去趋势处理。
3）通过巴特沃斯滤波器以55Hz 进行低通滤波。
4）通过肉眼进一步检查信号波形和频谱图，并使用EEGLAB进行独立成分分析以去除心脏伪影、眼动、肌电和其他伪影。
有噪音的脑电数据段按照以下步骤去除噪音
1）将数据分为2s一段
2）对于每段数据，如果其平均波幅大于整个信号平均波幅的四倍，或者其SD大于整个信号SD值的两倍，则剔除该段。
频谱分析
使用Chronux工具包的multi-taper法计算频谱，窗长2s，重叠率为50％，时间带宽积等于2，窗口等于3。主要计算前额叶（Fp1 Fp2的平均）、额叶（F5 F6 Fz的平均）和顶叶（P5 P6 Pz的平局）的功率谱。通过对所有被试的功率谱进行平均获得9个阶段的平均功率谱
功能连接计算
功能连接的计算指标为wPLI，该指标仅考虑两个信号的瞬时相位是超前还是滞后，较少受到容积传导效应和参考电极影响。如果一个信号的瞬时相位始终超前或滞后于另一信号，则该相位被认为是锁定的，wPLI等于1；另一方面，如果两个信号的相位超前或者滞后关系是随机的，则wPLI会比较低。如果两个信号之间没有相位差，则wPLI将为0。
将脑电数据分成30s一大段，步长为10s，然后再进一步分成2秒一小段，重叠率为50%。对于每个小段，使用multi-taper法计算交叉频谱密度，其中时间带宽积等于2，窗口等于3。
将30s长的脑电图信号按照10秒的步长进行划分，然后再划分为重叠50%的2秒子窗口。对于每个子窗口，使用多窗口方法估计交叉谱密度，其中时间带宽乘积等于2，窗口的数量等于3；最后采用改编的fieldtrip函数计算每个子窗口的wPLI。为了减少wPLI的潜在偏差，通过trial-shuffling法生成替代数据并计算其wPLI，然后用原始数据的wPLI减去替代数据的wPLI得到的差值作为功能连接的最终指标。
本研究重点考察三个区域（前额叶、额叶和顶叶）的皮层连接。因为研究表明这三个区域与麻醉药引起的意识丧失有关系。具体连接如下：额叶至顶叶的皮层连接即F5、F6、Fz和P5、P6、Pz；前额叶至额叶的皮层连接即Fp1、Fp2和F5、F6、Fz。此外还计算了delta[0.5—3Hz]、theta[3—7Hz]和alpha[7—15Hz]频段的额叶至顶叶、前额叶至额叶的平均皮层连通性。
手术全麻过程中的动态连接分析
首先，麻醉阶段是从皮肤切开后30s到手术结束后MAC（最小肺泡浓度）值为0.7的时候。选择大小为0.7的MAC值作为临床手术麻醉的下限，是担心在确定唤醒被试前，被试已经存在意识，也是为了让被试一直处在麻醉状态。MAC浓度已经根据被试的年龄做了适当地调整。将插管后2分钟（n=2）和意识丧失（n=1）用作替代指标。由于不好或不完整的脑电数据（n=5）或MAC数据不足（n=3），排除了53名被试中的8名。所以只选择45名被试的9段脑电数据并其对进行预处理。
（插管：在病人进入全麻状态后，麻醉医生会进行气管插管操作，即在喉镜等插管器械的辅助下把一根气管导管经病人的口腔或鼻腔插入病人的气管，气管导管的另一端连接麻醉机，由麻醉机通过气管导管给病人输送氧气，帮助病人呼吸。
拔管：当麻醉药物体内浓度降低到一定程度的时候，病人就可以恢复自主呼吸，意识也会清醒，此时麻醉医生会将气管导管拔出，继续给患者面罩吸氧，并吸除口腔分泌物。）
研究额叶至顶叶和前额叶至额叶的动态连接时，每个被试的脑电数据窗口大小为30s，步长为10s。由于激活抑制的存在无法可靠地估计功能皮层的连通性，因此排除了抑制率大于20％的时间窗。
根据5至30Hz的瞬时功率检测激活和抑制事件，然后使用根据手动标记的抑制周期确定的阈值，从而生成激活和抑制状态的二进制序列，根据该序列计算抑制比为每个30秒（重叠20秒）的二进制序列中抑制时间的百分比。仅选择抑制率小于20％的脑电数据时间窗用于后续的连通性分析。这样获得的连接模式是一个140维向量（每组向量都有70个频率估计值，范围为0.5到35Hz），该向量汇总了所有被试的结果，并使用主成分分析方法降维。最终将原始的140 维缩减为M维。然后利用k-means算法将M维连接模式划分为100个Nc簇，每个簇都可以视为具有不同频谱和空间的连接状态。除了这些连接状态之外，研究者还定义了一个附加状态“BS”，其中包含所有带有激活和抑制的时间窗口。因此，研究者获得了每个被试连续时间窗的连接状态的时间序列。
最后，为了评估连接状态时间序列的时间动态，研究者量化了特定状态的发生率以及每个状态的停留时间分布。前者是每个特定状态时间消耗的比例，后者是测量每个状态停留的时间长度。此外，为了研究皮层连接如何在不同状态之间转变，研究者假设连接状态的时间序列为马尔可夫链（即状态转移仅取决于当前状态）。研究者计算了每个被试停留在同一大脑连接状态的次数（即与时间t处于相同状态的时间t+1时的皮层连接）和转移到其他状态的次数。根据以往的研究，研究者推测皮层连接具有“粘性”，会驻留在相同的状态。
此外，研究者假设状态转移在状态和被试之间不那么频繁也不均匀。该分析以两种方式进行。首先，汇总所有被试的所有状态并计算相同状态i（i =1，2，…，N c +1）的累计停留时间以及转移到其他状态的次数j（j =1，2，…，Nc +1，j ≠ i）。然后将每个被试的状态停留时间和状态转移时间除以总的状态停留时间和状态转移时间，得到每个被试状态停留和状态转移的概率。最后，计算所有被试每对连接状态的转移概率 。对于从状态 i到状态 j的转移（ i，j =1，2，…， N c+1），通过计算该对状态转移的次数和所有被试的所有的状态转移（包括状态停留次数）总数的比值来估算转移概率，这样获得的矩阵可以表示每对连接状态的转移概率，矩阵的所有值总合为1。
统计分析
对于静态连接分析，研究者使用SPSS进行统计比较。首先分析九个阶段的连接差异，然后分析额叶至顶叶和前额叶至额叶连接模式的差异。使用线性混合建模分析补充缺失值，并使用随机截距模型来解决个体差异问题。针对不同频段的连接方式，不同时间段、不同区域的固定效应以及它们之间的相互作用，研究者使用限制极大似然估计法和方差分量作为随机效应模型的协方差结构。如果不同区域对固定效应模型具有统计学意义（P<0.05），那么在相对于预加氧之前，将每个时间段之间在额叶至顶叶、前额叶至额叶之间的连接进行成对比较，并记录差异估计的平均值、95％CI值以及经过Bonferroni校正的P值。
对于动态连接分析，使用MATLAB进行统计分析。数据的正态性由Lilliefors校正的Kolmogorov–Smirnov检验进行了评估。为了比较大脑皮层连接是保持在相同状态还是转移到其他状态，本文使用配对样本t检验来比较被试的状态保持和状态转移的概率。为了检测每对连接状态之间状态转移的显著性差异，使用多步替代数据检验分析法（multistep surrogate data analysis）。
首先，通过随机改组每个被试的连接状态时间序列来生成N=1000个替代时间序列，从而在保证状态出现率的同时对状态发生的时间顺序进行排列。关于状态间转移，研究者在去掉停留状态后，通过随机排列停留状态的时间序列（仅包括状态转移）来生成N = 1000个替代时间序列，并限制了所有被试在每个状态下的出现率。
对于每个替代时间序列，计算每对连接状态的转移概率，并且将原始数据的转移概率与替代数据的转移概率进行差异比较，显著性比较的值是通过累积分布函数获得的：
其中α表示原始转移概率, 如果不能避免替代数据正态性的零假设,psurro (h)表示估计的正态分布；否则表示经验替代分布。在所有研究状态转移的结果中，如果校正P 值小于0.05，则被认为是具有显著性差异的。
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结果
53名被试的人口学信息和手术特点如表2所示。被试的平均年龄为50±17岁，病例涵盖多个方面。
频谱分析
组水平频谱图如图2所示
图2：合并所有被试所有阶段的功率中位数（dB）而生成组水平功率谱图。对于每位被试，功率谱在前额叶（Fp1，Fp2）、额叶（F5，F6，Fz）和顶叶（P5，P6，Pz）上进行平均。LOC：失去知觉；PACU：麻醉后护理部分；Pre-oxy:预充氧;Pre-extub：拔管前；Post-extub:拔管后。
从频谱分析结果可以看出，在手术期间alpha和theta频段的功率都有所增加，其中alpha频段前额叶和额叶的增加最为明显。拔管前后，gamma频段功率均有所增加。与拔管后相比，麻醉后护理部分所有导联的gamma频段功率都有所降低。
围手术期的皮层连接
围手术期的组级连接结果如图3所示
图3：通过wPLI评估皮层功能连接在不同时间段的变化。
（A）图是额叶（F5，F6，Fz）和顶叶（P5，P6，Pz）、前额叶（Fp1，Fp2）和额叶平均wPLI的组水平连接图（对所有被试进行平均）。
（B）图是Apha（7至15Hz）、Theta（3至7Hz）和Delta（0.5至3Hz）频段的wPLI平均值和SD。
*表示再预充氧阶段，额叶至顶叶（蓝色）和前额叶至额叶（红色）的wPLI有明显变化（Bonferroni校正后的P<0.05）.＃表示使用线性混合模型分析，额叶顶壁和额叶前壁wPLI之间有显著差异（Bonferroni校正后的P<0.05）。
在预充氧阶段，alpha频段额叶至顶叶的皮层连接有显著性差异。与预充氧基线相比，其他所有阶段 alpha频段额叶至顶叶的皮层连接无显著性差异。
插管后，与基线相比，delta频段额叶至顶叶和前额叶至额叶的连接性增加。
在麻醉和手术期间，alpha频段前额叶至额叶的连接性增加（皮肤切开前：0.201[0.154，0.248]；P<0.001；第一段手术期间：0.169[0.123，0.215]，P<0.001；第二段手术期间：0.178[0.132，0.224]，P<0.001；第三段手术时期：0.173[0.127，0.219]，P<0.001）。
与额叶至顶叶的导联相比，alpha频段前额叶-额叶连通性在麻醉和手术期间也更强（皮肤切开：0.135[0.089，0.181]，P<0.001；第一段手术期间：0.077[0.032，0.122]，P=0.007；第二段手术期间：0.067[0.022，0.111]，P=0.030；第三段手术期间：0.078[0.033，0.122]，P=0.006）。
此外，与预加氧基准线相比，麻醉和手术时期theta频段额叶至顶叶的连接性均有所增强：（皮肤切开：0.114[0.068，0.160]，P<0.001；第一段手术期间：0.112[0.067，0.157]，P<0.001；第二段手术期间：0.128[0.084，0.173]，P<0.001;第三段手术期间：0.088[0.043，0.133]，P=0.001）。
Theta频段额叶至顶叶的连接也有所增强：（皮肤切口：0.117[0.071，0.162];P<0.001;第一段手术期间：0.137[0.091，0.182]；P＜0.001；第二段手术期间：0.123[0.079，0.168]；P＜0.001；第三段手术期间：0.076[0.031，0.121]；P＜0.001。P=0.007）。拔管前，alpha和theta的连接恢复到基线水平。
手术麻醉过程中皮层连接的动态模式
组水平上皮层连接表现出明显的空间和频谱特性。通过额叶至顶叶和前额叶至额叶的wPLI进行分析，探讨在个体水平皮层连接是静态的还是动态的。
额叶至顶叶和前额叶至额叶连接使用主成分分析降维，然后使用k-means分成五个簇。保留了前五个主要组成部分，占原始连接模式的63.1％。其中五个主成分和五个聚类的稳定性指数为0.30±0.08，1- minimum汉明距离为0.76±0.07。每个簇（连接状态）展示了其独特的空间和频谱特性的连接模式（图4A，表3））。
状态1和2的特点是额叶至顶叶的连接受到抑制时，前额叶至额叶的连接分别在10至20Hz和7至15Hz时增强，状态3的优势是在delta频段前额叶-额叶的连接，状态4和5分别展示了最小的前额叶至额叶连接，以及分别在theta和alpha频段上较高的额叶至顶叶连接。
基于这些特征模式的平方欧式距离，将每个时间窗分配给五个状态的其中之一，并将具有激活抑制的状态窗口作为另一个状态，称为“BS”，从而得到每个被试连接状态的时间序列。除少数手术时间较短的被试外，大多数被试的额叶至顶叶和前额叶至额叶的连接状态随时间变化。连接状态时间序列的时间动态通过每种状态的发生率（图4B）和保持时间的分布（图4C）进行评估。
从多次到达同一状态的情况看，停留时间从30秒到数十分钟不等。例如，对于所有状态，70.6%至80.8%的情况是在同一状态的停留时间长于30秒，其中8.2%至21.3%的停留时间长于2分钟。总体而言，这些结果表明皮层连接不是静态的，因为状态之间发生了转移。状态间和被试间的状态转移很少，并且变化很大。所有连接状态结果显示，皮层连接显示出很高的持久性，概率为86.6±8.1％，明显高于转移至其他状态的概率（概率为13.4±8.1％；P<0.001）。
另外，图4D显示了组水平的状态转移概率矩阵，每个方框表示从特定行的任意状态转移到特定列中的另一状态的概率，对角线上的值表示停留在某一状态的概率。很明显，与转移到不同状态的概率相比，在同一状态下一直停留的概率更大。与在停留状态下替代数据的转移概率相比，真实数据只有对角线上的概率明显高于替代数据（P<0.05）。
此外，研究者将替代数据的概率原始转移概率进行了比较（替代数据是指前面所提到的去除停留状态后对状态时间序列进行随机改组而生成的数据）。分析的结果表明，状态之间的转移不是均匀分布的，并且某些状态之间的转移比预测发生的概率要高（P<0.05）。
从图4E可以看出明显的停留状态概率和状态间转移概率。可以预期，前额叶至额叶连接性较高的两个状态（状态1和2）相互之间转移的可能性更高，额叶至顶叶连接性较高的两个状态（状态4和5）也很有可能相互转移。从与增量连接性相关的状态（状态3）转移出来时，仅状态2更有可能发生。换句话说，与转移到另一种状态相比，停留在某种连接状态的可能性更大，尽管在发生转移时，一些状态间的转移比其他状态间的转移更容易。
讨论
本研究在整个手术和全麻过程中评估皮层的动态连接，结果发现整个围手术期动态皮层连接具有一套独特的连接模式。
Alpha频段额叶至顶叶的连接无法区分不同的意识状态。麻醉药引起的意识丧失最初伴随着delta频段前额叶至额叶和额叶至顶叶的连接增强，并且在随后的麻醉和手术阶段中发现theta频段以及alpha频段前额叶至额叶的连接性逐渐增强。特别是在麻醉维持阶段，连接性在具有不同振荡和空间特性的神经生理状态之间转移。总体而言，这些结果表明，手术和麻醉期间大脑的状态会发生动态变化。
通过wPLI评估alpha频段额叶至顶叶的连接，发现无法通过单一的静态方法来区分手术患者的意识状态和麻醉状态。这些发现可能与先前的研究不一致，其表明全麻期间额叶至顶叶连接性受到了破坏。如果仅考虑预加氧阶段和插管阶段，alpha频段额叶至顶叶的连接性降低是具有显著性差异的。但是通过观察随后的手术和麻醉阶段，校正多个比较结果，并且与预充氧阶段相比，然后观察到动态连接性的变化后，发现在统计学上是不具有显著性差异的。与其他替代测量（例如，符号传输熵）可能得出不同的结果。因为wPLI对容积传导效应和参考电极的敏感性较低，所以本文选择其作为衡量指标。静态连接的方法也可能无法检测到麻醉过程中出现的丰富的网络和大脑状态的变化。
此外，在手术过程中测量额叶至顶叶连接时发现不良刺激可能会改变大脑前后区域之间的连通性。因此，补充分析可以集中在手术麻醉深度的额叶至顶叶连接模式上，要具有较长的持续时间（即，模拟手术的多个提示时间），并且不会被手术刺激而影响。还有就是大脑的状态需要更多的动态分析来区分意识水平。
尽管大脑的状态只保持在少数几个状态中，但是在麻醉维持期间甚至在手术刺激之前，状态的转移也经常发生，如图2，表明大脑状态之间存在动态相互作用，而不是静态平衡。尽管该假设需要在无需手术刺激、稳定的麻醉深度的情况下进行正式测试，但是这种模式也侧面反映了全身麻醉期间的亚稳定性。
最后，大脑状态之间的这种可能的“转移”反映了皮层沟通的中断，因为额叶超同步性阻碍了与颞叶和顶叶皮层的远程沟通。因此，这些发现可能表明全身麻醉期间状态连接有限性，从而无法灵活地处理或整合大脑中的信息。
总结
手术和麻醉期间，连接状态的动态波动非常明显，特别是在alpha和theta频段。因此，单一的连接指标（wPLI）不太可能成为手术麻醉的可靠依据。有必要进行后续调查以进一步了解本研究中观察到的动态状态变化的临床和科学意义。