单细胞ATAC-seq技术介绍

前言

单细胞ATAC-seq技术，顾名思义就是在单细胞水平上的ATAC-seq技术，它兼具单细胞技术的高分辨率及ATAC-seq的优势，是目前研究基因表观组学的热门技术。ATAC-seq的全称是Assay for transposase-accessible chromatin with high-throughput sequencing，是基于高通量测序对开放性染色质(open chromatin)进行研究的技术。

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开放染色质

在真核生物中，核DNA并不是裸露的，而是与组蛋白结合后压缩形成紧密的染色体高级结构。DNA在复制转录时，需要将DNA的紧密结构打开，这部分打开的染色质，就是开放染色质；开放染色质允许其他调控因子与之结合，这一特性被称为染色质的可及性，染色质的可及性被认为与转录调控密切相关。

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研究开放染色质的传统方法

传统研究开放染色质的方法有MNase-seq, DNase-seq, FAIRE-seq和ChIP-seq等，ChIP-seq一次只能获取特定转录因子结合的区域信息，而MNase-seq, DNase-seq和FAIRE-seq方法则费时费力，重复性较差。2013年，美国Stanford大学的William Greenleaf教授研发了一种全新的方法，即ATAC-seq，ATAC-seq在克服传统方法缺点的同时也保证了结果的可靠性，逐渐被大家所接受。

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单细胞ATAC-seq原理

ATAC-seq技术利用转座酶Tn5容易结合在开放染色质的特性，在切割获取DNA的同时加入接头，经过PCR扩增后即可进行高通量测序，获得全基因组范围内开放染色质的序列信息（图1）。

图1 转座酶Tn5作用示意图

单细胞ATAC-seq测序则是在此基础上与单细胞技术联合起来，例如联合单细胞组合标记测序技术（single-cell combinatorial indexed sequencing），在转座酶切割、PCR时引入index，达到识别单个细胞的目的（图2）。

图2 单细胞分离原理

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数据分析过程

高通量测序之后就是数据分析，首先对测序数据进行质量控制，如去除接头和重复序列等；之后使用bwa, bowtie2等工具与参考基因组进行比对；根据比对结果，利用MASC2等软件进行peak calling，peak指的是开放染色质富集的区域，这些区域在转录调控等方面可能发挥作用。得到每个细胞的peak分布情况后，进行peak注释，细胞分群，peak差异分析，转录因子富集分析等（图3）。

图3 ATAC分析流程

除此之外，还可以根据不同需求进行不同的分析，例如对细胞亚群进行注释、绘制细胞亚群的分化轨迹、结合GWAS研究细胞类型与疾病的关系。

单细胞ATAC-seq数据还能与其他组学数据进行联合分析，从而更好理解细胞的功能。

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分析结果概览

细胞质控（图4）会根据细胞内fragment在peak的占比识别真正的细胞，去除非细胞的barcode，保证后续分析的正确。

图4 细胞fragment分布图

Peak注释结果如图5，根据与基因转录起始位点（TSS）的距离，peak可以被注释为3类：启动子区域（promoter）, 末端区域（distal）和基因间区（intergenic）。

图5 peak注释结果

细胞分群结果（图6）是根据细胞间peak分布情况的异同进行分群。

图6 细胞分群tsne图

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应用

单细胞ATAC-seq是研究表观遗传学调控的利器，该技术经常被应用于疾病发生、细胞发育等方面。

Darren A C等人利用单细胞ATAC-seq技术绘制了雄性小鼠13个组织的染色质可及性图谱，发现了85类染色质可及性及约40万个潜在的调节元件，为了解哺乳动物的染色质可及性打下了基础。

首先根据单细胞的染色质可及性的异同将所有细胞分为85个亚群，并对亚群进行注释，得到小鼠的染色质可及性图谱；在此基础上，研究染色质可及性的组织特异性，以内皮细胞为例，发现内皮细胞可分为9个亚类，不同组织中的亚类组成有较大差异（图7）。作者还将单细胞ATAC-seq与GWAS（全基因组关联分析）结合起来，揭示了细胞类型与人类疾病的相关性。

图7 内皮细胞在组织中的分布

2018年发表在《cell》上题为“Integrated Single-Cell Analysis Maps the ContinuousRegulatory Landscape of Human Hematopoietic Differentiation”的文章，也是基于单细胞ATAC-seq技术。作者对造血分化过程进行研究，发现了造血分化过程中主要的调控因子GATA1, BATF, CEBPB等，从而揭示了人类造血分化的调节特性与动力学特征。

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参考文献

[1]Buenrostro J D , Giresi P G , Zaba L C , et al. Transposition of native chromatin for multimodal regulatory analysis and personal epigenomics[J]. Nature Methods, 2013, 10(12):1213-1218.

[2]Stuart T, Butler A, Hoffman P, et al. Comprehensive Integration of Single-Cell Data. Cell, 2019, 177(7):1888-1902.e21.

[3]Vitak S A , Torkenczy K A , Rosenkrantz J L , et al. Sequencing thousands of single-cell genomes with combinatorial indexing[J]. Nature Methods, 2017, 14(3):302-308.

[4]Darren A C, Andrew J H, Delasa A, et al. A Single-Cell Atlas of In Vivo Mammalian Chromatin Accessibility. Cell, 23 August 2018, 174(5):1309-1324.

[5]Buenrostro J D, Corces M R, Lareau C A, et al. Integrated single-cell analysis maps the continuous regulatory landscape of human hematopoietic differentiation[J].Cell, 2018.