为什么要选择单细胞核RNA测序？

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发布于 2020-09-14 17:31:41

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为什么要选择单细胞核RNA测序而非单细胞RNA测序

——单细胞核RNA测序的优势！

单细胞RNA测序技术的高通量和敏感性使其非常适合于全面绘制细胞状态的变化。但是在肾脏和其他固体组织中（尤其是对于高上皮含量的组织，以及以细胞外基质为特征的固体组织），单细胞RNA测序研究的一个大的挑战是如何获得高质量的单细胞悬浮液，高质量的单细胞悬浮液应该包含罕见或难以解离的细胞类型，细胞的mRNA不降解，基因的表达不受解离反应的影响。但是现实实验得到的结果确不是这样的，相信做过单细胞测序的科研人员都会遇到以下这样的问题：

单细胞RNA测序不能准确地捕获组织中所有细胞类型（比如肾脏，脑），因为单细胞解离本身可能损害敏感细胞。
目前用于单细胞解离的酶和机械方法会引入了因裂解压力诱导的转录产物。
活性蛋白酶倾向于选择易解离的细胞类型。不易解离的细胞可能会被丢失。
目前的方法与冷冻样本材料不兼容（冷冻样本不能用于单细胞测序），但是有的时候，临床所取的样本需要等待病理诊断后才能去做单细胞测序（比如肾脏活检样本），因此为了保证样本的RNA稳定性，需要进行冻存。

基于以上4点局限性，2019年，来自华盛顿大学医学院的Benjamin D. Humphreys团队通过比较分析了肾脏组织的单细胞RNA测序(scRNA-seq)和肾脏组织的单细胞核RNA测序(snRNA-seq)，在肾脏细胞类群鉴定中的区别，该研究成果发表在肾脏病学顶尖国际期刊J Am Soc Nephrol上（Advantages of Single-Nucleus over Single-Cell RNA Sequencing of Adult Kidney: Rare Cell Types and Novel Cell States Revealed in Fibrosis）。

研究人员将使用DropSeq平台的 (scRNA-seq与使用snuco -DropSeq、DroNc-seq和10X genomics三个平台的snRNA-seq结果进行了比较。并验证了snRNA-seq对小鼠单侧输尿管梗阻(UUO)术后14天肾脏纤维化的作用。

scRNA-seq测序结果显示，肾脏组织中共获得了10个细胞类群，但肾小球细胞类型缺失，此外，其中一个细胞类群主要由人为解离诱导的应激反应基因组成。相比之下， snRNA-seq捕获了多种在scRNA-seq数据集中不存在的肾脏细胞类型，包括肾小球足细胞、系膜细胞和内皮细胞。同时也未检测到应激反应基因。与已发表的scRNA-seq数据集(分别为2.4%和0.12%)相比， snRNA-seq方法产生了20倍以上的足细胞。令人意外的是，scRNA-seq平台和snRNA-seq平台的基因检测灵敏度相当。为了验证这一结论，对冷冻的第14天UUO肾脏的分析显示了罕见的肾小球旁细胞、新激活的近端小管和成纤维细胞状态，以及以前未识别的小管间质信号通路。

图：snRNA-seq相对于scRNA-seq技术具有较低的解离偏差。(A) tSNE显示了13个细胞类群。(B)不同类群的标记基因表达。(C) tSNE显示每个平台的数据对所有集群的贡献。(D)每个平台贡献的细胞百分比显示，与snRNA-seq相比，scRNA-seq技术对足细胞、内皮细胞和夹层细胞的检出率非常低 (E) snRNA-seq（2.4%）检测出的足细胞是scRNA-seq（0.12%）的20倍。

综上所述，与scRNAseq相比，snRNA-seq提供了更少的细胞解离偏倚和等效的基因检测。尽管snRNA-seq在不同基因中所占比例(7%)低于scRNA-seq，但其中许多是线粒体或人为应激反应基因，细胞鉴定没有受到损害。

2020年4月6日，来自Broad Institute of MIT and Harvard的Joshua Z. Levin团队在Nature Biotechnology上发表了文章Systematic comparison of single-cell and single-nucleus RNA-sequencing methods，

系统分析7种单细胞（核）RNA测序技术（图1），包括低通量的Smart-seq2，CEL-Seq2和五种高通量方法（三种基于微液滴技术，Drop-seq，inDrops, 10x-Chromium，一种基于微孔阵列的 Seq-Well，和基于组合标记的sci-RNA-seq)。其中，只有Smart-seq2是测整个RNA分子全长，其它六种方法都是测RNA分子的3片段端。对于这六种方法，UMI （unified molecular identifier）被用于消除PCR扩增而引起的偏差。

图1：研究概括

为了比较不同scRNA-seq系统，研究人员选择了常用的组织样本（图一），包括人和小鼠的细胞系，人外周血细胞，以及大鼠大脑皮层细胞（用于单细胞核RNA测序）。对每种组织样本，研究人员根据七种scRNA-seq方法同时并行处理。研究人员还开发了数据分析系统scumi（https://bitbucket.org/jerry00/scumi-dev/src/master/）可以分析来自于不同scRNA-seq系统的数据。对于其它不同于以上七种scRNA-seq技术的数据，scumi也可以分析，仅仅改动配置文件即可。

研究发现低通量的Smart-seq2和CEL-Seq2具有更高的敏感性，可以检测到更多的RNA分子。Smart-seq2可以测RNA分子全长，但是比CEL-Seq2更贵。然而，CEL-Seq2数据有可能包含污染（对于一个细胞，一部分来自于其它细胞的RNA分子可能被错误地标记为来自这个细胞）。对于高通量方法，10x Chromium （v3）具有最高的灵敏度。相对于10x Chromium （v2）数据，v3数据有更多的线粒体基因RNA。在细胞分类方面，10x Chromium表现最好（图二）。10x Chromium 数据具有相对较多的反义序列（antisense reads）。Drop-seq和inDrops具有较低的额灵敏度。然而对于细胞分类，通常并不需要太多RNA分子，所以inDrops和Drop-seq也可以检测到所有的细胞类型。需要注意的是Drop-seq和Seq-Well用的是同一种微球（beads），每个微球上所带的序列（用于标记来自于一个细胞的所有RNA分子）是完全随机的。而且厂家在制备微球时，一些微球上的序列在合成过程中产生了错误，比如只合成了十一位，而真正需要的是合成十二位的序列。对于Drop-seq，inDrops和Seq-Well，有相当大一部分数据没有正确的结构。比如，在正常情况下，在UMI序列后面是poly-T序列，但是一部分测序数据没有这样的结构。通常，这些没有正常结构的数据质量差，在分析中被丢弃了，导致测序数据的浪费。CEL-Seq2和inDrops是基于线性扩增，因而技术偏差较小。基于组合标记（combinatorial indexing）的sci-RNA-seq具有更好的扩展性（stability），可以在一个实验中制备上百万个细胞。然而，sci-RNA-seq可能还需要更近一步优化，因为在它在一些组织样本上表现不好，比如外周血。而且，这种方法可能容易受污染，比如在单细胞核测序中出现的不明确的细胞类型。

图二：用来自于不同scRNA-seq方法的数据在检测人外周血细胞类型的效果（AUC《=1,越大越好）。

这项研究中所有的原始数据都可以从GEO上下载 https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE132044处理后的数据可以在single cell portal下载和在线分析（访问号SCP424，SCP425，和SCP426）（例如，https://singlecell.broadinstitute.org/single_cell/study/SCP424）。这项研究为今后人们选择scRNA-seq方法提供了指导。同时，这项研究为scRNA-seq数据分析中的许多挑战问题提供了解决思路和方案，比如怎样从测序数据中选择真正的细胞而非空液滴，系统处理来自于不同scRNA-seq方法的数据，怎样选择各种后期处理参数，比如聚类分析参数等等。由于这项研究中用到的细胞都是实验室容易获得的，在今后，当研究者需要评估一种新的scRNA-seq方法或改进scRNA-seq方法时，她们可以直接比较他们所得新数据和这项研究中所得数据，而不需要重复已有实验。最后，对于计算机科学家或计算生物学家，这些数据可以用于设计和改进现有scRNA-seq数据处理方法。

这项研究由22位作者共同完成。作者包括来自于Broad Institute Aviv Regev实验室的博士后研究员Jiarui Ding(丁家锐)，研究科学家Xian Adiconis和Sean Simmons。通讯作者是来自于Broad Institute of MIT and Harvard 的Joshua Levin。

需要注意的是，一篇相关的文章，由来自于巴塞罗那 CNAG的科学家Holger Heyn任通讯作者的文章也发表在同一期的Nature Biotechnology上，题目为Benchmarking single-cell RNA-sequencing protocols for cell atlas projects。在Broad Institute的研究中，所有的scRNA-seq数据都在同一个研究所产生，因而可以更好的控制实验中的各种变量，比如实验开始时间，测序仪等。而CNAG的这项研究采取了一种互补的方法：首先创建细胞混合物（细胞来自于人，大鼠，还有1%的细胞来自于狗），然后把这些细胞混合物分发给世界上不同实验室。因而每一种scRNA-seq实验都是由在这种方法方面具有丰富经验的实验室专家完成，这样做的目的是减少实验人员对不同方法的熟悉程度对结果的影响。结果表明，低通量方法Quartz-seq2，Smart-seq2，和CEL-Seq2表现出色，高通量方法中，10x Chromium表现最好。