【生信文献200篇】08 scRNA-GBM-HNSCC-melanoma

00 文章信息

英文标题：Single-Cell Transcriptomic Analysis of Primary and Metastatic Tumor Ecosystems in Head and Neck Cancer

中文标题：头颈癌原发性和转移性肿瘤生态系统的单细胞转录组学分析

期刊：《Cell》

影响因子：38.637 发表时间：2017-11-30

研究领域：单细胞转录组学

DOI号：10.1016/j.cell.2017.10.044

01 文献概述

肿瘤中不同的恶性、间质和免疫细胞影响生长、转移和对治疗的反应。我们分析了18例头颈部鳞状细胞癌患者的6,000单细胞转录本，其中包括5对配对的原发肿瘤和淋巴结转移。基质细胞和免疫细胞在患者中有一致的表达程序。相反，肿瘤内和肿瘤之间的恶性细胞在与细胞周期、应激、缺氧、上皮分化和部分上皮向间充质转变(p-EMT)相关的信号的表达上存在差异。表达p-EMT程序的细胞在空间上定位于原发性肿瘤的前沿。通过整合数百个肿瘤的单细胞转录本和整体表达谱，我们根据其恶性和间质成分提炼了HNSCC亚型，并建立了p-EMT作为淋巴结转移、分级和不良病理特征的独立预测因子。我们的结果提供了对HNSCC生态系统的洞察力，并定义了间质相互作用和与转移相关的p-EMT计划。

Highlights

• Single-cell RNA-seq reveals diverse malignant, stromal, and immune cells
• Malignant cells vary in cell cycle, hypoxia, and epithelial expression programs
• A partial EMT program (p-EMT) at leading edge is regulated by the microenvironment
• Computational modeling refines TCGA subtypes, linking p-EMT to metastasis

02 文章背景

单细胞基因组学的最新进展为以细胞分辨率探索遗传和功能异质性提供了途径。对人类肿瘤，循环肿瘤细胞(CTC)和患者来源的异种移植物的单细胞RNA-seq (scRNA-seq)研究揭示了对肿瘤成分，癌症干细胞和药物耐药性的新见解。然而，尽管scRNA-seq研究占优势，但并未深入表征上皮肿瘤。在这些肿瘤中，转移至引流淋巴结(局部区域转移)和其他器官(远处转移)是发病率和死亡率的主要原因。转移瘤通常根据原发肿瘤的分子和病理特征进行治疗，这引发了一个问题，即它们是否具有相同的遗传学，表观遗传学和脆弱性。但是，原发性肿瘤和转移瘤的潜在组成可能不同，无法直接比较大块肿瘤的轮廓。

上皮向间质转化(EMT)被认为是上皮肿瘤扩散的驱动力。EMT的过程是胚胎发育的基础，可能被恶性上皮细胞所选择以促进其侵袭和传播。在与转移性疾病相关的四氯化碳上已检测到EMT标记。

头颈部鳞状细胞癌(HNSCC)是一种与酒精和烟草暴露密切相关的具有异质性的上皮肿瘤，患者往往在晚期出现的淋巴结转移(LN)，其中，超过80%的患者为口腔鳞状细胞癌(OSCC)。调查原发性 HNSCC 肿瘤和匹配的LN ，以更好地了解肿瘤内异质性，侵袭和转移。

03 实验数据

1

文章的实验设计

实验方法

• 肿瘤与病人样品
• cDNA合成与文库构建
• 流式细胞仪和细胞系分选
• TGFβ治疗和TGFBI过表达
• 使用CRISPR-Cas9进行TGFBI敲除
• 基质胶侵袭试验
• 细胞增殖测定
• 组织切片染色
• TCGA基质定量

分析

• 上皮分类
• CNV估算
• 分类为恶性和非恶性细胞
• 差异表达基因的鉴定
• 分类非恶性细胞
• 肿瘤内异质性表达程序
• 定义样本score
• 细胞类型之间的相互作用
• TCGA亚型分析
• 推断癌细胞特异性表达
• TCGA样品的p-EMT分层
• p-EMT和CAF评分的预后分析

2

数据分析

测序数据

We profiled transcriptomes of ∼6,000 single cells from 18 head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC) patients, including five matched pairs of primary tumors and lymph node metastases

同时也对这些病人进行WES and targeted genotyping(SNaPshot) data，但是这些数据公布在 phs001474.v1.p1 ，不方便下载。

单细胞转录组建库用的Smart-seq2方法，所有的数据公布在 GSE103322 ， 仅仅是表达矩阵，而且压缩后都有近100Mb了。

GSE103322_HNSCC_all_data.txt.gz（86.0 Mb），下载地址是：

# 可任选一个：
ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/geo/series/GSE103nnn/GSE103322/suppl/GSE103322_HNSCC_all_data.txt.gz
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/download/?acc=GSE103322&format=file&file=GSE103322_HNSCC_all_data.txt.gz

实验验证用的是细胞系 Oral cavity HNSCC cell lines (Cal-27, SCC9, SCC4, SCC25, and JHU-006; all derived from male patients) 做了RNA-seq 数据。

04 实验结果

1

A Single-Cell Expression Atlas of HNSCC Primary Tumors and Metastases

针对18位未接受过治疗的患者的原发肿瘤以及其中5位患者的LN转移生成了全长scRNA-seq图谱（图1A）流程图显示了原发性口腔HNSCC肿瘤和匹配的转移性LN的scRNA-seq的新鲜活检样本的收集和处理。

单细胞转录组数据分析CNV跟WES的对比

首先把所有病人的近6000个细胞根据表达模式区分成恶性与否，分成两组进行CNV聚类，可以看到恶性细胞的CNV模式跟从WES数据分析得到的CNV模式比较类似，说明了单细胞转录组数据分析CNV是靠谱的。当然，本身该课题组前面的几篇文章就提到了这个方法以及证实了其可靠性。

保留了来自18位患者的5,902个细胞的单细胞转录组（图S1A）

病人MEEI5的CNV情况

MEEI5 是一个69岁的女性，对来源于她的所有单细胞的转录组数据分析得到的CNV信息进行聚类可以看到比较清晰的patter，其中恶性与否比较容易区分，而且对于恶性细胞也可以看出原位癌和转移癌的区别。

（C）热图显示了5,902个单细胞（列）中上皮标记基因的表达，按这些基因的平均表达排序；

（D）小提琴图显示了基于CNV分类为恶性或非恶性细胞的上皮分数分布（上皮标记基因的平均表达）；

根据CNV和上皮标记物分析，绝大多数细胞是具有一致恶性或非恶性分类的簇的一部分。

2

Landscape of Expression Heterogeneity in Head and Neck Cancer

非恶性细胞的聚类没有个体差异

如果只对已经被区分出来的三千多个非恶性肿瘤细胞进行聚类，采取SC3算法，效果如下图，虽然有14个类别，但是根据已知标记基因的表达，可以注释为B细胞，巨噬细胞，树突状细胞，肥大细胞，内皮细胞，成纤维细胞和肌细胞这八个值得探究的类别。

值得注意的是，每个类含有来自不同患者的细胞，表明TME(这三千多个非恶性细胞就是肿瘤微环境)中的细胞类型和表达状态在HNSCC肿瘤中基本一致，并且没有患者特异性亚群或批处理效应，尽管它们的比例是不同的。

而且由于研究者的数据集中T细胞和成纤维细胞，即数量相对较多，研究者通过更精确的聚类发现了T细胞和成纤维细胞的多样性。如下：

单独查看成纤维细胞CAF

rv1,500成纤维细胞分成两个大类，一个小类别。

• 第一个类表达肌成纤维细胞的经典标记，包括α平滑肌肌动蛋白（ACTA2）和肌球蛋白轻链蛋白（MYLK，MYL9）。肌成纤维细胞是TME的成熟组分，并与伤口愈合和挛缩有关。
• 第二个类表达与癌相关成纤维细胞（CAF）相关的受体，配体和细胞外基质（ECM）基因，包括成纤维细胞活化蛋白（FAP），podoplanin（PDPN）和结缔组织生长因子（CTGF）。
• 第三个类基本不包括肌成纤维细胞和CAF的标记物，并可能代表处于静止状态的成纤维细胞。

其中还可以把CAFs（第二个类）分为具有立即早期应答基因（例如JUN，FOS），间充质标志物（例如VIM，THY1），配体和受体（例如FGF7）差异表达的两种类型（CAF1和CAF2），TGFBR2 / 3）和ECM蛋白质（例如MMP11，CAV1）。这种瘤内CAF异质性与TMF中涉及复杂结构和旁分泌相互作用的观点一致。

单独查看T细胞

主要T细胞类（rv1000个T细胞）可以分为四个亚群，研究者注释为：

• 调节性T细胞（Treg）
• 常规CD4 + T辅助细胞（CD4 + Tconv）
• 两种细胞毒性CD8 + T细胞群（CD8 + T和CD8 + Texhausted）

细胞毒素亚型在共抑制性受体（例如PD1，CTLA4）和与T细胞功能障碍和衰竭相关的其他基因的表达方面不同，并由此定义HNSCC中推定的T细胞耗竭程序。耗竭CD8 + T细胞的部分在研究者的队列患者中显著变化。这些T细胞表达状态可以为理解和预测检查点免疫疗法的反应提供帮助。

恶性细胞聚类完全取决于患者个体

与非恶性细胞相比，2215恶性细胞根据其起源的肿瘤聚类。超过2000个基因优先在个体肿瘤中表达。

• T细胞和成纤维细胞各自分为4个和3个子集

耗尽的CD8+ T细胞的比例差异很大

• 成纤维细胞PCA得出的PC1和PC2，三个簇着色，表明PC2进一步将CAF簇分为两个亚群（CAF1和CAF2，定义为具有PC2> 0，PC2 <0）

• CAF1和CAF2亚群之间差异表达的基因（行）的热图。所选基因用名称表示。

与非恶性细胞相比，2,215个恶性细胞各自聚集。超过2,000个基因在单个肿瘤中优先表达（图2D）

差异表达的基因富集在不同肿瘤之间的CNV中

3

Intra-tumoral Expression Heterogeneity of the Malignant Compartment

恶性细胞的基因特征

这里重点分析那些含有恶性细胞转录组最多数量的10对肿瘤样本。比如下面的病人MEEI25，一个76岁的女性：

研究者使用非负矩阵分解来揭示在恶性细胞亚群中得到优先共同表达的一系列基因。例如，对于MEEI25恶性细胞，研究者定义了6个不同的基因特征。对10个肿瘤样本中的每一个都应用该方法，共定义了60个基因特征。

接下来，研究者使用层次聚类来将这些60个特征提取成元特征，这些元特征反映了在多个肿瘤内变化的常见表达程序。来自不同肿瘤的特征之间的高一致性表明它们反映了肿瘤内表达异质性的共同模式。

层次聚类将这60个标记基因提取成反映多个肿瘤内不同的共同表达程序的meta-signatures (Figures 3B, S3A, and S3B)。不同肿瘤信号之间的高度一致性表明了肿瘤内表达异质性的共同模式。

分析结果表明，这个p-EMT程序不同于源自细胞系和肿瘤模型的完整EMT程序，以及源自肿瘤的肿瘤谱间充质特征。

4

A p-EMT Program in HNSCC

检查了ECM程序的EMT功能。此外，该程序中得分最高的基因之一是转化生长因子(TGF)-β诱导（TGFBI），这牵扯到经典的EMT调节剂TGF-β（图S3C）

EMT的部分状态或p-EMT

EMT程序被广泛认为是耐药，侵袭和转移的潜在驱动因素，是一个连续和变化的过程。因此，研究者仔细检查了ECM计划中EMT的特征。除ECM基因如基质金属蛋白酶，层粘连蛋白和整联蛋白外，该程序还包括EMT标志物波形蛋白（VIM）和整联蛋白α-5（ITGA5）。此外，该方案中得分最高的基因之一是转化生长因子（TGF）-b诱导（TGFBI），暗示经典的EMT调节剂TGF-b。

虽然该程序具有经典EMT的关键特征，但缺乏其他标志。

首先，虽然特征伴随着某些上皮基因的表达降低，但是上皮标记物的总体表达还是明显地保持下来。

其次，研究者没有检测到经典EMT TF，ZEB1 / 2，TWIST1 / 2和SNAIL1的表达。只有SNAIL2被检测到（在70％的HNSCC细胞中），尽管其表达与肿瘤的程序相关，但与肿瘤内个体细胞的程序并不相关。最近的研究表明SNAIL2比其他EMT TFs早。SNAIL2也涉及伤口愈合中的p-EMT应答。

因此，研究者建议这里确定的体内程序反映了一个EMT的部分状态或p-EMT。

（A）关联图显示了EMT和p-EMT程序之间的成对Pearson关联；

（B）散点图显示了三组TCGA肿瘤：① 高TCGA-mes /中间p-EMT，② 高p-EMT，③ 低p-EMT评分；

（C）热图证明（B）中所述人群的TCGA肿瘤（列）中的TCGA-Mes，CAF和p-EMT基因（行）与八个恶性特异性p-EMT基因的相对表达（“ Malig ”）显示在底部；

（D）p-EMT基因高度针对恶性细胞，而TCGA-mes基因与CAF相关。

5

In Vitro p-EMT Cells Are Dynamic and Invasive

五个HNSCC细胞系中p-EMT程序的功能意义

口腔腔内来源的细胞系SCC9中的一部分细胞部分概括了体内 p-EMT程序（图S3H）。

当通过流式细胞术分离这些p-EMT 高细胞时，它们显示出增加的侵袭性（图3D和3E）。它们的增殖率也降低（图3F），与患者样品的scRNA-seq分析（图S4E）和先前的EMT研究一致。

两种细胞在分选后4和24小时仍保持不同（t检验，p <0.0001；图S4H），但在培养4天后变得无法区分，两种培养物都重新概括了未分选SCC9细胞中标志物表达的分布（图3G， 3H，和S4H）

两种细胞在分选后4和24小时仍保持不同（t检验，p <0.0001；图S4 H）

• The dynamic nature of this in vitro program raises the possibility that the in vivo p-EMT program may also represent a transient state.

6

p-EMT Cells Localize to the Leading Edge in Proximity to CAFs

p-EMT program是动态的，侵入性的，并且可能对TME提示有反应。这使我们研究了在HNSCC肿瘤中表达该程序的细胞的原位空间定位。

免疫组化方法对p-EMT程序（PDPN，LAMC2，LAMB3，MMP10，TGFBI和ITGA5）的主要基因的肿瘤集合以及HNSCC标记p63进行了染色（图4A，4B和S5A –S5D）

这些实验揭示了一组恶性细胞，它们共同染有p-EMT标记，并位于与周围基质紧密并列的肿瘤前缘。每个scRNA-seq缺少p-EMT程序的肿瘤不会被这些标记物染色（图S5E–S5G）

上皮分化标记（SPRR1B，CLDN4）在肿瘤的核心（图4C和S5H–S5K ）上染色了一组不同的细胞，这与scRNA-seq数据中这些程序之间的负相关性一致（图4D ）

（H和I）用于上皮分化（SPRR1B，CLDN4）和恶性细胞特异性标记物p63的代表性肿瘤（MEEI16，MEEI17）的免疫组织化学染色。

（J和K）对p-EMT（LAMC2，PDPN）和上皮分化（CLDN4）的代表性肿瘤（MEEI17）的免疫组织化学染色。标记分别在前缘和核心展示了p-EMT和上皮分化程序的独特空间定位。

（D）散点图显示了p-EMT程序与HNSCC肿瘤内异质性基础的其他表达程序之间的Pearson相关性

（E）条形图描绘了恶性HNSCC细胞与所示细胞类型之间的推定受体-配体相互作用的数目

恶性细胞的“传入”信号时，CAF显著表达了更高数量的配体，这些配体与恶性细胞表达的受体相对应（图4E和S5L）。这些包括可能促进EMT的相互作用，例如TGFB3-TGFBR2，FGF7-FGFR2和CXCL12-CXCR7（图4 F）

因此，当我们对肿瘤进行CAF标记（FAP，PDPN）染色时，我们发现CAF出现在前边缘的p-EMT细胞附近（图4C和S5M）

为了评估配体-受体相互作用的功能意义，我们用TGF-β处理了SCC9细胞，在抑制TGF-β时被抑制（图 4G和4H）。TGF-β也增加了侵袭性并减少了增殖，而抑制作用却相反（图 4I 和S5N）

TGFBI（p-EMT最高基因）的过表达对浸润性和增殖也产生了类似的影响（图S4F和图S4G）。

相反，TGFBI的基因失活消除了TGF-β反应（Figures S5O and S5P）。

尽管我们试图在共培养物中测试来自原发肿瘤的CAF ，无法诱导p-EMT应答（图S5R）。

综上所述，这些数据表明，CAF和恶性细胞之间的旁分泌相互作用促进了HNSCC肿瘤前沿的p-EMT program，在肿瘤浸润中具有潜在作用。

7

Intra-tumoral HNSCC Heterogeneity Recapitulated in Locoregional Metastases

外显子数据分析somatic突变

LN转移与原发性肿瘤比较

研究者将LN转移与原发性肿瘤（只有5个病人是取了配对样本）进行了比较。尽管WES和推测的CNV显示了原发性和匹配的LN样本之间的存在一些基因组差异，但是可能是由于所研究的个体数量较少，他们没有鉴别出任何一致的区别。

LN中恶性细胞的表达谱也与相应的原发肿瘤大致匹配。在每个配对样本中，都有较少的差异表达基因是显著差异的，但是它们在整个群体（cohort）中不一致。

研究者还观察到淋巴结和原发性肿瘤间质和免疫细胞的特征和表现的总体一致性，虽然有一些重要的区别！

所有患者的原发性肿瘤和LN之间p-EMT高和低亚群的存在也一致（图S6C和S6D）

LN成纤维细胞富含成肌纤维细胞和CAF1亚型，并优先表达某些受体和配体（例如IL1R1，MMP11，SPARC）（图5B，S2E，和S6E）

恶性细胞的完整上皮结构或“巢”（图S6F和S6G）在其周围具有p-EMT标记，被CAF和其他TME成分包围。

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HNSCC Subtypes Refined by Deconvolution of Bulk Expression Data

（A）来自十个肿瘤的恶性细胞的t-SNE图

（B）来自十个肿瘤的非恶性细胞的t-SNE图

（C）对于每个TCGA亚型（列），热图显示非恶性细胞类型（行）的基因标记的相对表达，这些表达被用作细胞类型丰度的估计值。分类为间充质高表达基因的肿瘤特异于CAF和心肌细胞，而非典型肿瘤则富含T细胞和B细胞。

（A）间质中的基质浸润明显多于基底肿瘤

（B）（左）柱状图显示，与基础肿瘤相比，间充质肿瘤中基质浸润的百分比显著更高（右）条形图显示了间充质和基础亚型TCGA肿瘤的H＆E基质评分从0（最低）到4（最高）的肿瘤数量

（C和D）散点图显示H＆E基质评分（以点色表示）与CAF和TCGA间充质评分（C）之间的相关性，而不与p-EMT评分（D）相关。

这一发现提出了一种可能性，即TCGA间充质亚型反映大批量样品中的高基质表现而不是独特的恶性细胞程序。实际上，TCGA样品的分析鉴定到间充质亚型肿瘤高度表达对CAF和肌细胞特异性的基因。此外，当研究者检查TCGA的HNSCC肿瘤的组织学切片时，鉴定到间充质肿瘤的成纤维细胞比基础型肿瘤多大约2.7倍（t检验，p <0.0001）。

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p-EMT Predicts Metastasis and Adverse Pathological Features

TCGA中恶性基底肿瘤的p-EMT水平最高（图S7E）。对恶性基底型TCGA肿瘤的主要成分分析（而非典型和非典型肿瘤）显示，前两个成分与p-EMT基因的表达相关，并且与上皮分化基因呈负相关（图7A，7B，S7F和S7G）。

他们独立地确认除了SNAIL2（图S7L）外，不存在经典的EMT TF，并且进一步支持了人类肿瘤的体内 p-EMT状态。

高p-EMT分数与LN转移的存在和数量以及较高的淋巴结分期相关，p-EMT与原发肿瘤大小无关（图7C），提示与侵袭和转移直接相关，但与肿瘤生长无关。p-EMT基因是具有这些临床特征的最相关的基因之一，而其他program（例如细胞周期或缺氧）的相关性却不那么强。

重要的是，p-EMT program可以更有效地预测淋巴结转移和局部浸润（图S7I）而非TCGA间充质程序或常规EMT基因，二者均主要反映CAF频率（图S4A和S7I）。p-EMT评分可以帮助预测淋巴结转移（图S7J）。

05 延伸板块

1.单细胞转录组的CNV可以区分细胞恶性与否：

对单细胞转录组数据计算基因组层面的CNV信息，这个概念最早来自于Aviv Regev实验室，在她的一系列文章里面得到了淋漓尽致的展示。

Aviv Regev：早年在以色列的特拉维夫大学(Tel Aviv University)攻读硕士学位，在其跨学科卓越项目（Interdisciplinary Program for the Fostering of Excellence）中学习生物学、计算机科学和数学，之后在特拉维夫大学取得计算生物学博士学位。女神作为一个计算与系统生物学家，目前就职于麻省理工学院，为生物学教授，同时也是霍华德休斯医学研究所(Howard Hughes Medical Institute)的研究员、以及Broad Institute的卡曼细胞观测与细胞回路项目(the Klarman Cell Observatory and Cell Circuits Program)的领头人、和国际人类细胞图谱计划(the international Human Cell Atlas project)的共同主席。

其2014的science关于GBM的单细胞转录组文章：

• DOI: 10.1126/science.1254257
• 标题是：《Single-cell RNA-seq highlights intratumoral heterogeneity in primary glioblastoma》

而且当时把单细胞转录组的CNV算法在CCLE的数据里面验证了，如下图：

2.CNV分析流程

1、 什么是CNV

CNV（copy-numbervariant）是指拷贝数目变异，也称拷贝数目多态性（copy-number polymorphism，CNP），是大小介于1kb至3MB的DNA片段的变异，其覆盖的核苷酸总数大大超过单核苷酸多态性（SNP）的总数，极大地丰富了基因组遗传变异的多样性。按照CNV是否致病可分为致病性CNV、非致病性CNV和不明临床意义CNV。

2、TCGA的CNV测量及计算

二倍体区域的片段平均值为零，扩增的区域的值为正，缺失的区域的值为负。

TCGA中主要是通过Affymetrix SNP6.0 array芯片测拷贝数变异。CCLE也有SNP6.0芯片数据且可以下载。

3、 TCGA的CNV数据下载

可以去broad institute下载TCGA的数据，所有的文件都以目录的形式存放着。

4、 CNV深度分析

1）注释基因

2） 找somatic CNVs

关于CNV的数据下载及分析内容可查看 ↓ ， 此处以文献分享为主，便不再Ctrl+C/V了~ 生信技能树，公众号：生信技能树TCGA的28篇教程-CNV全攻略

3.黑色素瘤的单细胞转录组测序揭示复发转移过程

单细胞转录组技术已经广泛应用于肿瘤的复发和转移：

选择了 19个黑色素瘤病人，获得了4645个单细胞，进行转录组测序：

In a new studyExit Disclaimer published in Science, researchers from the Broad InstituteExit Disclaimer employed a single-cell sequencing technique to analyze RNA expression in 4,645 individual cells from 19 melanoma tumors.

在发表于“科学”杂志上的一项新研究中，来自Broad Institute的研究人员采用单细胞测序技术分析了19个黑色素瘤肿瘤中4,645个单个细胞中的RNA表达。分析显示在同一肿瘤内同时表达两种不同的基因表达程序影响治疗抗性和复发。先前的利用大量测序的研究已经发现，与具有MITF表达程序的肿瘤相比，特征在于靶向基因治疗的表达的黑素瘤肿瘤。通过分析单细胞RNA测序的MITF与AXL表达程序，研究人员发现，高MITF表达的肿瘤也包含一系列以AXL为特征的细胞，在每个肿瘤中形成一个连续的基因表达。

在用黑素瘤患者和细胞系中的MAPK抑制剂治疗后，表现AXL表达程序的单细胞数量增加。这些发现还表明，AXL表达可能导致黑色素瘤复发，即使在以前通过批量测序表征为MITF肿瘤的肿瘤中。

发现肿瘤生态系统：该研究还利用单细胞RNA测序来确定免疫治疗反应的潜在影响因素。通过分析微环境中对抗黑素瘤非常重要的单个T细胞，研究人员确定了一组能区分T细胞能够有效反应的基因。这表明分析单个T细胞可能有助于预测患者对靶向免疫疗法的反应。

这些独特的黑色素瘤细胞的新见解不仅揭示了黑色素瘤的关键基因组和临床属性，而且推荐单细胞方法作为未来癌症基因组研究的重要工具。这些研究可以辨别哪些肿瘤细胞参与介导药物反应，并有助于开发针对肿瘤生态系统的每个组分的治疗。

4.EMT

癌症中的上皮间质转化（EMT）标志物：E-cadherin、N-cadherin和vimentin。

• E- cadherin：其表达的降低是 EMT 和癌症转移过程中的基本事件，并且已经成为癌性 EMT 的分子标记；
• N-cadherin：在多类癌症中，E-cadherin的缺失通常与间充质钙粘蛋白（例如 N-cadherin）的表达增加有关，并且被视为肿瘤细胞获得侵袭性的必要条件；
• Vimentin：波形蛋白的过表达与多种癌症的侵袭性和转移增加有关。

SNAIL

上皮和间充质基因的表达在 EMT 过程中的变化受到多个转录因子家族的调节，包括 SNAI1/Snail、ZEB1/ZEB2 和基本螺旋-环-螺旋（basic helix-loop-helix）转录因子

激活上皮间质转化（EMT）是癌细胞转移的关键过程，在此过程中，上皮细胞获得间充质细胞的特征，细胞运动性和迁移能力增强。EMT 的特征在于上皮细胞标志物（例如cytokeratins和 E-cadherin）缺失，间充质细胞标志物（例如 N-cadherin、vimentin和纤连蛋白）的表达上调。

这些上皮细胞标志物和间充质细胞标志物的表达变化导致过渡细胞与相邻上皮细胞之间的粘附减少，而降解细胞外基质的酶的分泌增加

总的来说，这样会导致上皮细胞失去顶基细胞极性，重组细胞骨架，并重编基因表达；促进侵袭性表型在癌症转移中的发展

5.WES流程

前提：

安装所需软件；

熟悉参考基因组及必备数据库；

具体流程：

1.QC

2.读质量较好的测序数据进行比对

3.最简单的找变异流程

4.去除PCR重复

5.完善的GATK流程

6.检查感兴趣基因区域内比对和找变异情况

7.所有样本走samtools mpileup 和bcftools call 流程

8.比对及找变异结果的质控

9.VCF下游分析，主要是：注释和过滤

06 部分缩写词

• HNSCC：头颈部鳞状细胞癌
• LN：淋巴结转移
• TCGA：癌症基因组图谱
• CAF：癌相关成纤维细胞
• CTC：循环肿瘤细胞
• scRNAseq：单细胞RNA测序
• TME：肿瘤微环境
• WES：全外显子组测序
• SNaPshot：靶向基因分型
• EMT：Epithelial-to-mesenchymal transition
• PNI：perineural invasion;
• LVI：lymphovascular invasion;
• ECE：extracapsular extension

呐，等你关注都等出蜘蛛网了~