单细胞工具箱|Seurat官网标准流程
学习单细胞转录组肯定先来一遍Seurat官网的标准流程。
数据来源于Peripheral Blood Mononuclear Cells (PBMC)，共2700个单细胞， Illumina NextSeq 500平台。下载链接在这：https://cf.10xgenomics.com/samples/cell/pbmc3k/pbmc3k_filtered_gene_bc_matrices.tar.gz
解压到目录下，有以下三个文件，也是10X的标准文件
barcodes.tsv ,genes.tsv, matrix.mtx
一 加载R包 数据集
Seurat可以直接用Read10X函数读取cellranger的结果数据，使用pbmc数据初始化Seurat对象
library(dplyr)
library(Seurat)
library(patchwork)
# Load the PBMC dataset
pbmc.data <- Read10X(data.dir = "./data/hg19/") #解压缩后的路径
# Initialize the Seurat object with the raw (non-normalized data).
pbmc <- CreateSeuratObject(counts = pbmc.data, project = "pbmc3k", min.cells = 3, min.features = 200)
pbmc查看count matrix矩阵
#查看数据
dim(pbmc.data)
# 32738 2700
# Lets examine a few genes in the first thirty cells
pbmc.data[c("CD3D", "TCL1A", "MS4A1"), 1:30]3 x 30 sparse Matrix of class "dgCMatrix" [[ suppressing 30 column names ‘AAACATACAACCAC-1’, ‘AAACATTGAGCTAC-1’, ‘AAACATTGATCAGC-1’ ... ]]
CD3D 4 . 10 . . 1 2 3 1 . . 2 7 1 . . 1 3 . 2 3 . . . . . 3 4 1 5
TCL1A . . . . . . . . 1 . . . . . . . . . . . . 1 . . . . . . . .
MS4A1 . 6 . . . . . . 1 1 1 . . . . . . . . . 36 1 2 . . 2 . . . .
其中的.表示0，即no molecules detected。seurat使用一个稀疏矩阵来保存count matrix，节省存储空间。
二 数据预处理
2.1 QC
一般使用以下三个标准，也可以参考commonly used
- 每个细胞中检测到的唯一基因数
- 低质量的细胞或者空的droplet液滴通常含有很少的基因
- Cell doublets 或 multiplets 可能表现出异常高的基因计数
- 每个细胞中检测到的分子总数
- 线粒体基因含量比例
- 低质量或者死亡细胞含有很高的线粒体基因
- 使用PercentageFeatureSet()计算线粒体QC比例
- MT-开头的基因是线粒体基因
# The [[ operator can add columns to object metadata. This is a great place to stash QC stats
pbmc[["percent.mt"]] <- PercentageFeatureSet(pbmc, pattern = "^MT-")
# Show QC metrics for the first 5 cells
head(pbmc@meta.data, 5)## orig.ident nCount_RNA nFeature_RNA percent.mt
## AAACATACAACCAC-1 pbmc3k 2419 779 3.0177759
## AAACATTGAGCTAC-1 pbmc3k 4903 1352 3.7935958
## AAACATTGATCAGC-1 pbmc3k 3147 1129 0.8897363
## AAACCGTGCTTCCG-1 pbmc3k 2639 960 1.7430845
## AAACCGTGTATGCG-1 pbmc3k 980 521 1.2244898注意PercentageFeatureSet函数可以计算每个CELL中的指定基因子集的计数百分比。
小提琴图：查看基因数目, UMI数目, 线粒体基因占比
# Visualize QC metrics as a violin plot
VlnPlot(pbmc, features = c("nFeature_RNA", "nCount_RNA", "percent.mt"), ncol = 3)
基因数目, 线粒体基因占比与UMI数目相关性
# FeatureScatter is typically used to visualize feature-feature relationships, but can be used
# for anything calculated by the object, i.e. columns in object metadata, PC scores etc.
plot1 <- FeatureScatter(pbmc, feature1 = "nCount_RNA", feature2 = "percent.mt")
plot2 <- FeatureScatter(pbmc, feature1 = "nCount_RNA", feature2 = "nFeature_RNA")
plot1 + plot2
过滤
- 过滤具有UMI计数超过 2500 或小于 200的细胞
- 过滤具有>5%线粒体的细胞
pbmc <- subset(pbmc, subset = nFeature_RNA > 200 & nFeature_RNA < 2500 & percent.mt < 5)2.2 数据标准化
默认标准化方法为LogNormalize，标化后的数据存在pbmc[["RNA"]]@data中。
pbmc <- NormalizeData(pbmc, normalization.method = "LogNormalize", scale.factor = 10000)
#pbmc <- NormalizeData(pbmc)如果我记不住这些[[ 和 @ 怎么办？
使用最“简单，通用”的方式，str(pbmc) 查看一下数据结构，然后根据结构对应使用@ 或者 $ 。
str(pbmc)
#截取部分展示用
Formal class 'Seurat' [package "SeuratObject"] with 13 slots
..@ assays :List of 1
.. ..$ RNA:Formal class 'Assay' [package "SeuratObject"] with 8 slots
.. .. .. ..@ counts :Formal class 'dgCMatrix' [package "Matrix"] with 6 slots
.. .. .. .. .. ..@ i : int [1:2238732] 29 73 80 148 163 184 186 227 229 230 ...
.. .. .. .. .. ..@ p : int [1:2639] 0 779 2131 3260 4220 4741 5522 6304 7094 7626 ...
.. .. .. .. .. ..@ Dim : int [1:2] 13714 2638
.. .. .. .. .. ..@ Dimnames:List of 2
.. .. .. .. .. .. ..$ : chr [1:13714] "AL627309.1" "AP006222.2" "RP11-206L10.2" "RP11-206L10.9" ...
.. .. .. .. .. .. ..$ : chr [1:2638] "AAACATACAACCAC-1" "AAACATTGAGCTAC-1" "AAACATTGATCAGC-1" "AAACCGTGCTTCCG-1" ...
.. .. .. .. .. ..@ x : num [1:2238732] 1 1 2 1 1 1 1 41 1 1 ...
.. .. .. .. .. ..@ factors : list()
.. .. .. ..@ data :Formal class 'dgCMatrix' [package "Matrix"] with 6 slots
.. .. .. .. .. ..@ i : int [1:2238732] 29 73 80 148 163 184 186 227 229 230 ...
.. .. .. .. .. ..@ p : int [1:2639] 0 779 2131 3260 4220 4741 5522 6304 7094 7626 ...
.. .. .. .. .. ..@ Dim : int [1:2] 13714 2638
.. .. .. .. .. ..@ Dimnames:List of 2
.. .. .. .. .. .. ..$ : chr [1:13714] "AL627309.1" "AP006222.2" "RP11-206L10.2" "RP11-206L10.9" ...
.. .. .. .. .. .. ..$ : chr [1:2638] "AAACATACAACCAC-1" "AAACATTGAGCTAC-1" "AAACATTGATCAGC-1" "AAACCGTGCTTCCG-1" ...
.. .. .. .. .. ..@ x : num [1:2238732] 1.64 1.64 2.23 1.64 1.64 ...
.. .. .. .. .. ..@ factors : list()
.. .. .. ..@ scale.data : num[0 , 0 ]
.. .. .. ..@ key : chr "rna_"
.. .. .. ..@ assay.orig : NULL
.. .. .. ..@ var.features : chr(0)
.. .. .. ..@ meta.features:'data.frame': 13714 obs. of 0 variables
.. .. .. ..@ misc : list()
..@ meta.data :'data.frame': 2638 obs. of 5 variables:
.. ..$ orig.ident : Factor w/ 1 level "pbmc3k": 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 ...
.. ..$ nCount_RNA : num [1:2638] 2419 4903 3147 2639 980 ...
.. ..$ nFeature_RNA: int [1:2638] 779 1352 1129 960 521 781 782 790 532 550 ...
.. ..$ percent.mt : num [1:2638] 3.02 3.79 0.89 1.74 1.22 ...
.. ..$ percent.HB : num [1:2638] 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 ...根据层级结构找到 data 即可， pbmc@assays$RNA@data （标准化后的数据）
另：pbmc@assays$RNA@counts为原始count数据
简单看一下标准化前后的数据
par(mfrow = c(1,2))
hist(colSums(pbmc$RNA@counts),breaks = 50)
hist(colSums(pbmc$RNA@data),breaks = 50)
2.3 高变基因（特征选择）
选择数据集中高变异的特征子集（在某些细胞中高表达，在其他细胞中低表达）。通过Seurat内置的FindVariableFeatures()函数，计算每一个基因的均值和方差，默认选择高变的2000个基因用于下游分析。
标示Top10的基因 以及 标示目标基因
pbmc <- FindVariableFeatures(pbmc, selection.method = "vst", nfeatures = 2000)
# Identify the 10 most highly variable genes
top10 <- head(VariableFeatures(pbmc), 10)
# plot variable features with and without labels
plot1 <- VariableFeaturePlot(pbmc)
#标示TOP10的基因
plot2 <- LabelPoints(plot = plot1, points = top10, repel = TRUE)
#标示感兴趣的基因
plot3 <- LabelPoints(plot = plot1, points = c(top10,"HLA-DPB1","CCL4"), repel = TRUE)
plot2 + plot3
2.4 归一化
使用ScaleData()函数线性转换（"归一化"）数据，使得每一个基因在所有cell中的表达均值为0，方差为1.
结果在pbmc[["RNA"]]@scale.data #同样可以通过str的方式根据数据结构获取。
all.genes <- rownames(pbmc)
pbmc <- ScaleData(pbmc, features = all.genes)有需要的话也可以移出不必要的来源数据？
pbmc <- ScaleData(pbmc, vars.to.regress = "percent.mt")三 PCA 降维
3.1 使用scale后的数据进行PCA分析，默认表达变化大的基因。可以使用features参数重新定义数据集。
pbmc <- RunPCA(pbmc, features = VariableFeatures(object = pbmc))可视化方式包含以下几种，VizDimReduction(), DimPlot() 和 DimHeatmap()
# Examine and visualize PCA results a few different ways
print(pbmc[["pca"]], dims = 1:5, nfeatures = 5)PC_ 1 Positive: CST3, TYROBP, LST1, AIF1, FTL
Negative: MALAT1, LTB, IL32, IL7R, CD2
PC_ 2
Positive: CD79A, MS4A1, TCL1A, HLA-DQA1, HLA-DQB1
Negative: NKG7, PRF1, CST7, GZMA, GZMB
PC_ 3
Positive: HLA-DQA1, CD79A, CD79B, HLA-DQB1, HLA-DPA1
Negative: PPBP, PF4, SDPR, SPARC, GNG11
PC_ 4
Positive: HLA-DQA1, CD79B, CD79A, MS4A1, HLA-DQB1
Negative: VIM, IL7R, S100A6, S100A8, IL32
PC_ 5
Positive: GZMB, FGFBP2, S100A8, NKG7, GNLY
Negative: LTB, IL7R, CKB, MS4A7, RP11-290F20.3
3.2 可视化展示
1）dims指定展示几个PCs ， nfeatures指定每个PC展示多少基因
VizDimLoadings(pbmc, dims = 1:2,
nfeatures = 20,
reduction = "pca")
2） PCA点图
DimPlot(pbmc, reduction = "pca")
3） PCA热图
DimHeatmap(pbmc,
dims = 1:4, #几个PCs
cells = 600, #多少cell
ncol = 2, #图形展示几列
balanced = TRUE)
四 确定维度
如何确定使用多少PCA呢？以下2种方法科研作为参考
4.1 JackStrawPlot
使用JackStrawPlot()函数对PCA结果进行可视化，"重要"的PC 将会显示在虚线上方且P值较低，本示例中PC10-PC12后显著性下降较明显。较耗时。
# NOTE: This process can take a long time for big datasets, comment out for expediency. More
# approximate techniques such as those implemented in ElbowPlot() can be used to reduce
# computation time
pbmc <- JackStraw(pbmc, num.replicate = 100)
pbmc <- ScoreJackStraw(pbmc, dims = 1:20)
JackStrawPlot(pbmc, dims = 1:15)
4.2 Elbow图
展示每个主成分对数据方差的解释情况（百分比表示），并进行排序。发现第9个主成分是一个拐点，后续的主成分(PC)变化不大。
ElbowPlot(pbmc)
A：以上结果“供参考”；
B：Seurat官网鼓励用户使用不同数量的PC（10、15，甚至50）重复下游分析，虽然结果通常没有显著差异。
C：建议设置此参数时偏高一些，较少维度进行下游分析可能会对结果产生一些负面影响。
4.3 显著相关基因
这个也可以作为后面分析选择基因的一个参考。
#Returns a set of genes, based on the JackStraw analysis, that have statistically significant associations with a set of PCs.
?PCASigGenes
head(PCASigGenes(pbmc,pcs.use=2,pval.cut = 0.7))
[1] "PPBP" "LYZ" "S100A9" "IGLL5" "GNLY" "FTL"五 聚类
基于PCA结果进行聚类；
大约3K细胞的单细胞数据集，将resolution参数设置在0.4-1.2之间，数据集增加resolution 值对应增加。这个参数的设置目前没有找到标准，有清楚的小伙伴欢迎后台告知，谢谢。
pbmc <- FindNeighbors(pbmc, dims = 1:10)
pbmc <- FindClusters(pbmc, resolution = 0.5)
# Look at cluster IDs of the first 5 cells
head(Idents(pbmc), 5)
head(pbmc@active.ident,5) #同上AAACATACAACCAC-1 AAACATTGAGCTAC-1 AAACATTGATCAGC-1 AAACCGTGCTTCCG-1 AAACCGTGTATGCG-1 0 3 2 1 6
Levels: 0 1 2 3 4 5 6 7 8
5.1 查看指定cluster的cell
head(subset(as.data.frame(pbmc@active.ident),pbmc@active.ident=="2"))pbmc@active.identAAACATTGATCAGC-1 2
AAACGCACTGGTAC-1 2
AAAGCCTGTATGCG-1 2
AAATCAACTCGCAA-1 2
AAATGTTGCCACAA-1 2
AACACGTGCAGAGG-1 2
5.2 提取某一cluster细胞
subpbmc<-subset(x = pbmc,idents="2")
subpbmc
head(subpbmc@active.ident,5)AAACATTGATCAGC-1 AAACGCACTGGTAC-1 AAAGCCTGTATGCG-1 AAATCAACTCGCAA-1 AAATGTTGCCACAA-1 2 2 2 2 2
Levels: 2
六 非线性降维聚类
建议使用与聚类分析相同的pc维度进行非线性降维度分析，如tSNE和UMAP，并可视化展示。
6.1 UMAP
# If you haven't installed UMAP, you can do so via reticulate::py_install(packages =
# 'umap-learn')
pbmc <- RunUMAP(pbmc, dims = 1:10)
# note that you can set `label = TRUE` or use the LabelClusters function to help label
# individual clusters
DimPlot(pbmc, reduction = "umap")
6.2 tSNE
pbmc <- RunTSNE(pbmc, dims = 1:10)
head(pbmc@reductions$tsne@cell.embeddings)
DimPlot(pbmc, reduction = "tsne")
6.3 比较
# note that you can set `label = TRUE` or use the LabelClusters function to help label
# individual clusters
plot1<-DimPlot(pbmc, reduction = "umap",label = TRUE)
plot2<-DimPlot(pbmc, reduction = "tsne",label = TRUE)
plot1 + plot2
可以看出，两者的降维可视化的结构是一致的，UMAP方法相对更加紧凑。
七 差异表达基因
Seurat可以通过FindMarkers函数 和 FindAllMarkers函数寻找不同cluster的差异表达基因。
min.pct参数:设定在两个细胞群中任何一个被检测到的百分比，通过此设定不检测很少表达基因来缩短程序运行时间。默认0.1
thresh.test参数：设定在两个细胞群中基因差异表达量。可以设置为0 ，程序运行时间会更长。
max.cells.per.ident参数：每个类群细胞抽样设置；也可以缩短程序运行时间。
7.1 特定cluster
是one-others的差异分析方法，由ident.1来制定cluster，本例就是cluster2与其余的cluster来做比较。
# find all markers of cluster 2
cluster2.markers <- FindMarkers(pbmc, ident.1 = 2, min.pct = 0.25)
head(cluster2.markers, n = 5)## p_val avg_log2FC pct.1 pct.2 p_val_adj
## IL32 2.593535e-91 1.2154360 0.949 0.466 3.556774e-87
## LTB 7.994465e-87 1.2828597 0.981 0.644 1.096361e-82
## CD3D 3.922451e-70 0.9359210 0.922 0.433 5.379250e-66
## IL7R 1.130870e-66 1.1776027 0.748 0.327 1.550876e-62
## LDHB 4.082189e-65 0.8837324 0.953 0.614 5.598314e-617.2 指定cluster
本例为cluster5 和 cluster0_cluster3的差异
# find all markers distinguishing cluster 5 from clusters 0 and 3
cluster5.markers <- FindMarkers(pbmc, ident.1 = 5, ident.2 = c(0, 3), min.pct = 0.25)
head(cluster5.markers, n = 5)p_val avg_log2FC pct.1 pct.2 p_val_adjFCGR3A 8.331882e-208 4.261784 0.975 0.040 1.142634e-203
CFD 1.932644e-198 3.423863 0.938 0.036 2.650429e-194
IFITM3 2.710023e-198 3.876058 0.975 0.049 3.716525e-194
CD68 1.069778e-193 3.013656 0.926 0.035 1.467094e-189
RP11-290F20.3 4.218926e-190 2.722303 0.840 0.016 5.785835e-186
7.3 FindAllMarkers
每个cluster分别与其他所有cluster进行比较，展示各个cluster的前2个基因
# find markers for every cluster compared to all remaining cells, report only the positive ones
pbmc.markers <- FindAllMarkers(pbmc, only.pos = TRUE, min.pct = 0.25, logfc.threshold = 0.25)
pbmc.markers %>%
group_by(cluster) %>%
top_n(n = 2, wt = avg_log2FC)# A tibble: 18 x 7# Groups: cluster [9]
p_val avg_log2FC pct.1 pct.2 p_val_adj cluster gene
<dbl> <dbl> <dbl> <dbl> <dbl> <fct> <chr>
1 1.88e-117 1.08 0.913 0.588 2.57e-113 0 LDHB
2 5.01e- 85 1.34 0.437 0.108 6.88e- 81 0 CCR7
3 0 5.57 0.996 0.215 0 1 S100A9
4 0 5.48 0.975 0.121 0 1 S100A8
5 1.93e- 80 1.27 0.981 0.65 2.65e- 76 2 LTB
6 2.91e- 58 1.27 0.667 0.251 3.98e- 54 2 CD2
7 0 4.31 0.939 0.042 0 3 CD79A
8 1.06e-269 3.59 0.623 0.022 1.45e-265 3 TCL1A
9 3.60e-221 3.21 0.984 0.226 4.93e-217 4 CCL5
10 4.27e-176 3.01 0.573 0.05 5.85e-172 4 GZMK
11 3.51e-184 3.31 0.975 0.134 4.82e-180 5 FCGR3A
12 2.03e-125 3.09 1 0.315 2.78e-121 5 LST1
13 3.17e-267 4.83 0.961 0.068 4.35e-263 6 GZMB
14 1.04e-189 5.28 0.961 0.132 1.43e-185 6 GNLY
15 1.48e-220 3.87 0.812 0.011 2.03e-216 7 FCER1A
16 1.67e- 21 2.87 1 0.513 2.28e- 17 7 HLA-DPB1
17 7.73e-200 7.24 1 0.01 1.06e-195 8 PF4
18 3.68e-110 8.58 1 0.024 5.05e-106 8 PPBP
?FindAllMarkers查看更多参数。
cluster0.markers <- FindMarkers(pbmc, ident.1 = 0, logfc.threshold = 0.25,
test.use = "roc", # 检验的方式
only.pos = TRUE) #只输出pos的基因其中test.use 可选参数有：wilcox（默认），bimod，roc，t，negbinom，poisson，LR，MAST，DESeq2。
7.4 可视化
可以通过seurat的内置函数查看重点基因的基本情况：
1）VlnPlot: 基因表达概率分布
VlnPlot(pbmc, features = c("MS4A1", "CD79A"))
# you can plot raw counts as well
VlnPlot(pbmc, features = c("NKG7", "PF4"), slot = "counts", log = TRUE)
2）FeaturePlot：在tSNE 或 PCA图中展示重点基因的表达
FeaturePlot(pbmc, features = c("MS4A1", "GNLY", "CD3E", "CD14", "FCER1A", "FCGR3A", "LYZ", "PPBP",
"CD8A"))
3）DoHeatmap()查看重点基因细胞和cluster的表达热图
top10 <- pbmc.markers %>%
group_by(cluster) %>%
top_n(n = 10, wt = avg_log2FC)
DoHeatmap(pbmc, features = top10$gene) + NoLegend()
此外，还建议使用RidgePlot()、CellScatter()和DotPlot()查看数据集的情况。
这也可以作为后续手动注释的一些参考。
参考资料：
https://satijalab.org/seurat/articles/pbmc3k_tutorial.html#standard-pre-processing-workflow-1
◆ ◆ ◆ ◆ ◆