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单细胞工具箱|Seurat官网标准流程

学习单细胞转录组肯定先来一遍Seurat官网的标准流程。

数据来源于Peripheral Blood Mononuclear Cells (PBMC),共2700个单细胞, Illumina NextSeq 500平台。下载链接在这:https://cf.10xgenomics.com/samples/cell/pbmc3k/pbmc3k_filtered_gene_bc_matrices.tar.gz

解压到目录下,有以下三个文件,也是10X的标准文件

barcodes.tsv ,genes.tsv, matrix.mtx

一 加载R包 数据集

Seurat可以直接用Read10X函数读取cellranger的结果数据,使用pbmc数据初始化Seurat对象

library(dplyr)
library(Seurat)
library(patchwork)

# Load the PBMC dataset
pbmc.data <- Read10X(data.dir = "./data/hg19/") #解压缩后的路径
# Initialize the Seurat object with the raw (non-normalized data).
pbmc <- CreateSeuratObject(counts = pbmc.data, project = "pbmc3k", min.cells = 3, min.features = 200)
pbmc

查看count matrix矩阵

#查看数据
dim(pbmc.data)
# 32738  2700

# Lets examine a few genes in the first thirty cells
pbmc.data[c("CD3D", "TCL1A", "MS4A1"), 1:30]

3 x 30 sparse Matrix of class "dgCMatrix" [[ suppressing 30 column names ‘AAACATACAACCAC-1’, ‘AAACATTGAGCTAC-1’, ‘AAACATTGATCAGC-1’ ... ]]

CD3D 4 . 10 . . 1 2 3 1 . . 2 7 1 . . 1 3 . 2 3 . . . . . 3 4 1 5

TCL1A . . . . . . . . 1 . . . . . . . . . . . . 1 . . . . . . . .

MS4A1 . 6 . . . . . . 1 1 1 . . . . . . . . . 36 1 2 . . 2 . . . .

其中的.表示0,即no molecules detected。seurat使用一个稀疏矩阵来保存count matrix,节省存储空间。

二 数据预处理

2.1 QC

一般使用以下三个标准,也可以参考commonly used

  1. 每个细胞中检测到的唯一基因数
  • 低质量的细胞或者空的droplet液滴通常含有很少的基因
  • Cell doublets 或 multiplets 可能表现出异常高的基因计数
  1. 每个细胞中检测到的分子总数
  2. 线粒体基因含量比例
  • 低质量或者死亡细胞含有很高的线粒体基因
  • 使用PercentageFeatureSet()计算线粒体QC比例
  • MT-开头的基因是线粒体基因
# The [[ operator can add columns to object metadata. This is a great place to stash QC stats
pbmc[["percent.mt"]] <- PercentageFeatureSet(pbmc, pattern = "^MT-")

# Show QC metrics for the first 5 cells
head(pbmc@meta.data, 5)
##                  orig.ident nCount_RNA nFeature_RNA percent.mt
## AAACATACAACCAC-1     pbmc3k       2419          779  3.0177759
## AAACATTGAGCTAC-1     pbmc3k       4903         1352  3.7935958
## AAACATTGATCAGC-1     pbmc3k       3147         1129  0.8897363
## AAACCGTGCTTCCG-1     pbmc3k       2639          960  1.7430845
## AAACCGTGTATGCG-1     pbmc3k        980          521  1.2244898

注意PercentageFeatureSet函数可以计算每个CELL中的指定基因子集的计数百分比。

小提琴图:查看基因数目, UMI数目, 线粒体基因占比

# Visualize QC metrics as a violin plot
VlnPlot(pbmc, features = c("nFeature_RNA", "nCount_RNA", "percent.mt"), ncol = 3)

基因数目, 线粒体基因占比与UMI数目相关性

# FeatureScatter is typically used to visualize feature-feature relationships, but can be used
# for anything calculated by the object, i.e. columns in object metadata, PC scores etc.

plot1 <- FeatureScatter(pbmc, feature1 = "nCount_RNA", feature2 = "percent.mt")
plot2 <- FeatureScatter(pbmc, feature1 = "nCount_RNA", feature2 = "nFeature_RNA")
plot1 + plot2

过滤

  • 过滤具有UMI计数超过 2500 或小于 200的细胞
  • 过滤具有>5%线粒体的细胞
pbmc <- subset(pbmc, subset = nFeature_RNA > 200 & nFeature_RNA < 2500 & percent.mt < 5)
2.2 数据标准化

默认标准化方法为LogNormalize,标化后的数据存在pbmc[["RNA"]]@data中。

pbmc <- NormalizeData(pbmc, normalization.method = "LogNormalize", scale.factor = 10000)
#pbmc <- NormalizeData(pbmc)

如果我记不住这些[[ 和 @ 怎么办?

使用最“简单,通用”的方式,str(pbmc) 查看一下数据结构,然后根据结构对应使用@ 或者 $ 。

str(pbmc) 
#截取部分展示用
Formal class 'Seurat' [package "SeuratObject"] with 13 slots
  ..@ assays      :List of 1
  .. ..$ RNA:Formal class 'Assay' [package "SeuratObject"] with 8 slots
  .. .. .. ..@ counts       :Formal class 'dgCMatrix' [package "Matrix"] with 6 slots
  .. .. .. .. .. ..@ i       : int [1:2238732] 29 73 80 148 163 184 186 227 229 230 ...
  .. .. .. .. .. ..@ p       : int [1:2639] 0 779 2131 3260 4220 4741 5522 6304 7094 7626 ...
  .. .. .. .. .. ..@ Dim     : int [1:2] 13714 2638
  .. .. .. .. .. ..@ Dimnames:List of 2
  .. .. .. .. .. .. ..$ : chr [1:13714] "AL627309.1" "AP006222.2" "RP11-206L10.2" "RP11-206L10.9" ...
  .. .. .. .. .. .. ..$ : chr [1:2638] "AAACATACAACCAC-1" "AAACATTGAGCTAC-1" "AAACATTGATCAGC-1" "AAACCGTGCTTCCG-1" ...
  .. .. .. .. .. ..@ x       : num [1:2238732] 1 1 2 1 1 1 1 41 1 1 ...
  .. .. .. .. .. ..@ factors : list()
  .. .. .. ..@ data         :Formal class 'dgCMatrix' [package "Matrix"] with 6 slots
  .. .. .. .. .. ..@ i       : int [1:2238732] 29 73 80 148 163 184 186 227 229 230 ...
  .. .. .. .. .. ..@ p       : int [1:2639] 0 779 2131 3260 4220 4741 5522 6304 7094 7626 ...
  .. .. .. .. .. ..@ Dim     : int [1:2] 13714 2638
  .. .. .. .. .. ..@ Dimnames:List of 2
  .. .. .. .. .. .. ..$ : chr [1:13714] "AL627309.1" "AP006222.2" "RP11-206L10.2" "RP11-206L10.9" ...
  .. .. .. .. .. .. ..$ : chr [1:2638] "AAACATACAACCAC-1" "AAACATTGAGCTAC-1" "AAACATTGATCAGC-1" "AAACCGTGCTTCCG-1" ...
  .. .. .. .. .. ..@ x       : num [1:2238732] 1.64 1.64 2.23 1.64 1.64 ...
  .. .. .. .. .. ..@ factors : list()
  .. .. .. ..@ scale.data   : num[0 , 0 ] 
  .. .. .. ..@ key          : chr "rna_"
  .. .. .. ..@ assay.orig   : NULL
  .. .. .. ..@ var.features : chr(0) 
  .. .. .. ..@ meta.features:'data.frame':	13714 obs. of  0 variables
  .. .. .. ..@ misc         : list()
  ..@ meta.data   :'data.frame':	2638 obs. of  5 variables:
  .. ..$ orig.ident  : Factor w/ 1 level "pbmc3k": 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 ...
  .. ..$ nCount_RNA  : num [1:2638] 2419 4903 3147 2639 980 ...
  .. ..$ nFeature_RNA: int [1:2638] 779 1352 1129 960 521 781 782 790 532 550 ...
  .. ..$ percent.mt  : num [1:2638] 3.02 3.79 0.89 1.74 1.22 ...
  .. ..$ percent.HB  : num [1:2638] 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 ...

根据层级结构找到 data 即可, pbmc@assays$RNA@data (标准化后的数据)

另:pbmc@assays$RNA@counts为原始count数据

简单看一下标准化前后的数据
par(mfrow = c(1,2))
hist(colSums(pbmc$RNA@counts),breaks = 50)
hist(colSums(pbmc$RNA@data),breaks = 50)
2.3 高变基因(特征选择)

选择数据集中高变异的特征子集(在某些细胞中高表达,在其他细胞中低表达)。通过Seurat内置的FindVariableFeatures()函数,计算每一个基因的均值和方差,默认选择高变的2000个基因用于下游分析。

标示Top10的基因 以及 标示目标基因

pbmc <- FindVariableFeatures(pbmc, selection.method = "vst", nfeatures = 2000)

# Identify the 10 most highly variable genes
top10 <- head(VariableFeatures(pbmc), 10)

# plot variable features with and without labels
plot1 <- VariableFeaturePlot(pbmc)
#标示TOP10的基因
plot2 <- LabelPoints(plot = plot1, points = top10, repel = TRUE)
#标示感兴趣的基因
plot3 <- LabelPoints(plot = plot1, points = c(top10,"HLA-DPB1","CCL4"), repel = TRUE)

plot2 + plot3
2.4 归一化

使用ScaleData()函数线性转换("归一化")数据,使得每一个基因在所有cell中的表达均值为0,方差为1.

结果在pbmc[["RNA"]]@scale.data #同样可以通过str的方式根据数据结构获取。

all.genes <- rownames(pbmc)
pbmc <- ScaleData(pbmc, features = all.genes)

有需要的话也可以移出不必要的来源数据?

pbmc <- ScaleData(pbmc, vars.to.regress = "percent.mt")

三 PCA 降维

3.1 使用scale后的数据进行PCA分析,默认表达变化大的基因。可以使用features参数重新定义数据集。

pbmc <- RunPCA(pbmc, features = VariableFeatures(object = pbmc))

可视化方式包含以下几种,VizDimReduction(), DimPlot() 和 DimHeatmap()

# Examine and visualize PCA results a few different ways
print(pbmc[["pca"]], dims = 1:5, nfeatures = 5)

PC_ 1 Positive: CST3, TYROBP, LST1, AIF1, FTL

Negative: MALAT1, LTB, IL32, IL7R, CD2

PC_ 2

Positive: CD79A, MS4A1, TCL1A, HLA-DQA1, HLA-DQB1

Negative: NKG7, PRF1, CST7, GZMA, GZMB

PC_ 3

Positive: HLA-DQA1, CD79A, CD79B, HLA-DQB1, HLA-DPA1

Negative: PPBP, PF4, SDPR, SPARC, GNG11

PC_ 4

Positive: HLA-DQA1, CD79B, CD79A, MS4A1, HLA-DQB1

Negative: VIM, IL7R, S100A6, S100A8, IL32

PC_ 5

Positive: GZMB, FGFBP2, S100A8, NKG7, GNLY

Negative: LTB, IL7R, CKB, MS4A7, RP11-290F20.3

3.2 可视化展示

1)dims指定展示几个PCs , nfeatures指定每个PC展示多少基因

VizDimLoadings(pbmc, dims = 1:2,
               nfeatures = 20, 
               reduction = "pca")

2) PCA点图

DimPlot(pbmc, reduction = "pca")

3) PCA热图

DimHeatmap(pbmc, 
           dims = 1:4,  #几个PCs
           cells = 600, #多少cell
           ncol = 2, #图形展示几列
           balanced = TRUE)

四 确定维度

如何确定使用多少PCA呢?以下2种方法科研作为参考

4.1 JackStrawPlot

使用JackStrawPlot()函数对PCA结果进行可视化,"重要"的PC 将会显示在虚线上方且P值较低,本示例中PC10-PC12后显著性下降较明显。较耗时。

# NOTE: This process can take a long time for big datasets, comment out for expediency. More
# approximate techniques such as those implemented in ElbowPlot() can be used to reduce
# computation time
pbmc <- JackStraw(pbmc, num.replicate = 100)
pbmc <- ScoreJackStraw(pbmc, dims = 1:20)

JackStrawPlot(pbmc, dims = 1:15)
4.2 Elbow图

展示每个主成分对数据方差的解释情况(百分比表示),并进行排序。发现第9个主成分是一个拐点,后续的主成分(PC)变化不大。

ElbowPlot(pbmc)

A:以上结果“供参考”;

B:Seurat官网鼓励用户使用不同数量的PC(10、15,甚至50)重复下游分析,虽然结果通常没有显著差异。

C:建议设置此参数时偏高一些,较少维度进行下游分析可能会对结果产生一些负面影响。

4.3 显著相关基因

这个也可以作为后面分析选择基因的一个参考。

#Returns a set of genes, based on the JackStraw analysis, that have statistically significant associations with a set of PCs.
?PCASigGenes
head(PCASigGenes(pbmc,pcs.use=2,pval.cut = 0.7))
[1] "PPBP"   "LYZ"    "S100A9" "IGLL5"  "GNLY"   "FTL"

五 聚类

基于PCA结果进行聚类;

大约3K细胞的单细胞数据集,将resolution参数设置在0.4-1.2之间,数据集增加resolution 值对应增加。这个参数的设置目前没有找到标准,有清楚的小伙伴欢迎后台告知,谢谢。

pbmc <- FindNeighbors(pbmc, dims = 1:10)
pbmc <- FindClusters(pbmc, resolution = 0.5)

# Look at cluster IDs of the first 5 cells
head(Idents(pbmc), 5)

head(pbmc@active.ident,5) #同上

AAACATACAACCAC-1 AAACATTGAGCTAC-1 AAACATTGATCAGC-1 AAACCGTGCTTCCG-1 AAACCGTGTATGCG-1 0 3 2 1 6

Levels: 0 1 2 3 4 5 6 7 8

5.1 查看指定cluster的cell
head(subset(as.data.frame(pbmc@active.ident),pbmc@active.ident=="2"))
pbmc@active.identAAACATTGATCAGC-1 2

AAACGCACTGGTAC-1 2

AAAGCCTGTATGCG-1 2

AAATCAACTCGCAA-1 2

AAATGTTGCCACAA-1 2

AACACGTGCAGAGG-1 2

5.2 提取某一cluster细胞
subpbmc<-subset(x = pbmc,idents="2")
subpbmc

head(subpbmc@active.ident,5)

AAACATTGATCAGC-1 AAACGCACTGGTAC-1 AAAGCCTGTATGCG-1 AAATCAACTCGCAA-1 AAATGTTGCCACAA-1 2 2 2 2 2

Levels: 2

六 非线性降维聚类

建议使用与聚类分析相同的pc维度进行非线性降维度分析,如tSNE和UMAP,并可视化展示。

6.1 UMAP
# If you haven't installed UMAP, you can do so via reticulate::py_install(packages =
# 'umap-learn')
pbmc <- RunUMAP(pbmc, dims = 1:10)

# note that you can set `label = TRUE` or use the LabelClusters function to help label
# individual clusters
DimPlot(pbmc, reduction = "umap")
6.2 tSNE
pbmc <- RunTSNE(pbmc, dims = 1:10)
head(pbmc@reductions$tsne@cell.embeddings)
DimPlot(pbmc, reduction = "tsne")
6.3 比较
# note that you can set `label = TRUE` or use the LabelClusters function to help label
# individual clusters
plot1<-DimPlot(pbmc, reduction = "umap",label = TRUE)
plot2<-DimPlot(pbmc, reduction = "tsne",label = TRUE)
plot1 + plot2

可以看出,两者的降维可视化的结构是一致的,UMAP方法相对更加紧凑。

七 差异表达基因

Seurat可以通过FindMarkers函数 和 FindAllMarkers函数寻找不同cluster的差异表达基因。

min.pct参数:设定在两个细胞群中任何一个被检测到的百分比,通过此设定不检测很少表达基因来缩短程序运行时间。默认0.1

thresh.test参数:设定在两个细胞群中基因差异表达量。可以设置为0 ,程序运行时间会更长。

max.cells.per.ident参数:每个类群细胞抽样设置;也可以缩短程序运行时间。

7.1 特定cluster

是one-others的差异分析方法,由ident.1来制定cluster,本例就是cluster2与其余的cluster来做比较。

# find all markers of cluster 2
cluster2.markers <- FindMarkers(pbmc, ident.1 = 2, min.pct = 0.25)
head(cluster2.markers, n = 5)
##             p_val avg_log2FC pct.1 pct.2    p_val_adj
## IL32 2.593535e-91  1.2154360 0.949 0.466 3.556774e-87
## LTB  7.994465e-87  1.2828597 0.981 0.644 1.096361e-82
## CD3D 3.922451e-70  0.9359210 0.922 0.433 5.379250e-66
## IL7R 1.130870e-66  1.1776027 0.748 0.327 1.550876e-62
## LDHB 4.082189e-65  0.8837324 0.953 0.614 5.598314e-61
7.2 指定cluster

本例为cluster5 和 cluster0_cluster3的差异

# find all markers distinguishing cluster 5 from clusters 0 and 3
cluster5.markers <- FindMarkers(pbmc, ident.1 = 5, ident.2 = c(0, 3), min.pct = 0.25)
head(cluster5.markers, n = 5)

p_val avg_log2FC pct.1 pct.2 p_val_adjFCGR3A 8.331882e-208 4.261784 0.975 0.040 1.142634e-203

CFD 1.932644e-198 3.423863 0.938 0.036 2.650429e-194

IFITM3 2.710023e-198 3.876058 0.975 0.049 3.716525e-194

CD68 1.069778e-193 3.013656 0.926 0.035 1.467094e-189

RP11-290F20.3 4.218926e-190 2.722303 0.840 0.016 5.785835e-186

7.3 FindAllMarkers

每个cluster分别与其他所有cluster进行比较,展示各个cluster的前2个基因

# find markers for every cluster compared to all remaining cells, report only the positive ones
pbmc.markers <- FindAllMarkers(pbmc, only.pos = TRUE, min.pct = 0.25, logfc.threshold = 0.25)
pbmc.markers %>%
    group_by(cluster) %>%
    top_n(n = 2, wt = avg_log2FC)
# A tibble: 18 x 7# Groups: cluster [9]

p_val avg_log2FC pct.1 pct.2 p_val_adj cluster gene

<dbl> <dbl> <dbl> <dbl> <dbl> <fct> <chr>

1 1.88e-117 1.08 0.913 0.588 2.57e-113 0 LDHB

2 5.01e- 85 1.34 0.437 0.108 6.88e- 81 0 CCR7

3 0 5.57 0.996 0.215 0 1 S100A9

4 0 5.48 0.975 0.121 0 1 S100A8

5 1.93e- 80 1.27 0.981 0.65 2.65e- 76 2 LTB

6 2.91e- 58 1.27 0.667 0.251 3.98e- 54 2 CD2

7 0 4.31 0.939 0.042 0 3 CD79A

8 1.06e-269 3.59 0.623 0.022 1.45e-265 3 TCL1A

9 3.60e-221 3.21 0.984 0.226 4.93e-217 4 CCL5

10 4.27e-176 3.01 0.573 0.05 5.85e-172 4 GZMK

11 3.51e-184 3.31 0.975 0.134 4.82e-180 5 FCGR3A

12 2.03e-125 3.09 1 0.315 2.78e-121 5 LST1

13 3.17e-267 4.83 0.961 0.068 4.35e-263 6 GZMB

14 1.04e-189 5.28 0.961 0.132 1.43e-185 6 GNLY

15 1.48e-220 3.87 0.812 0.011 2.03e-216 7 FCER1A

16 1.67e- 21 2.87 1 0.513 2.28e- 17 7 HLA-DPB1

17 7.73e-200 7.24 1 0.01 1.06e-195 8 PF4

18 3.68e-110 8.58 1 0.024 5.05e-106 8 PPBP

?FindAllMarkers查看更多参数。

cluster0.markers <- FindMarkers(pbmc, ident.1 = 0, logfc.threshold = 0.25, 
                                test.use = "roc",  # 检验的方式
                                only.pos = TRUE) #只输出pos的基因

其中test.use 可选参数有:wilcox(默认),bimod,roc,t,negbinom,poisson,LR,MAST,DESeq2。

7.4 可视化

可以通过seurat的内置函数查看重点基因的基本情况:

1)VlnPlot: 基因表达概率分布

VlnPlot(pbmc, features = c("MS4A1", "CD79A"))
# you can plot raw counts as well
VlnPlot(pbmc, features = c("NKG7", "PF4"), slot = "counts", log = TRUE)

2)FeaturePlot:在tSNE 或 PCA图中展示重点基因的表达

FeaturePlot(pbmc, features = c("MS4A1", "GNLY", "CD3E", "CD14", "FCER1A", "FCGR3A", "LYZ", "PPBP", 
    "CD8A"))

3)DoHeatmap()查看重点基因细胞和cluster的表达热图

top10 <- pbmc.markers %>%
    group_by(cluster) %>%
    top_n(n = 10, wt = avg_log2FC)
DoHeatmap(pbmc, features = top10$gene) + NoLegend()

此外,还建议使用RidgePlot()、CellScatter()和DotPlot()查看数据集的情况。

这也可以作为后续手动注释的一些参考。

参考资料:

https://satijalab.org/seurat/articles/pbmc3k_tutorial.html#standard-pre-processing-workflow-1

◆ ◆ ◆ ◆ ◆

本文分享自微信公众号 - 生信补给站(Bioinfo_R_Python),作者:生信补给站

原文出处及转载信息见文内详细说明,如有侵权,请联系 yunjia_community@tencent.com 删除。

原始发表时间:2021-08-09

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    也就是说,大概率上你感兴趣的疾病都会有现成的公共数据,你完全可以选择从你感兴趣的角度来对它进行分析。而不是跑一下各个标准代码,得到一个唾手可得的结论糊弄大家。科...

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  • SPOTlight || 用NMF解卷积空间表达数据

    Giotto|| 空间表达数据分析工具箱 Seurat 新版教程:分析空间转录组数据(上) Seurat 新版教程:分析空间转录组数据(下) scanpy教程:...

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  • dyno使用教程--1个R包实现59种单细胞轨迹推断分析

    A comparison of single-cell trajectory inference methods[1](Saelens et al., 2019...

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  • 单细胞分析十八般武艺9:DoubletFinder

    单细胞测序期望每个barcode标签下只有一个真实的细胞,但是实际数据中会有两个或多个细胞共用一个barcode的情况,业内称之为doublets或multip...

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  • 单细胞类型注释工具singleR

    目前用于单细胞类型鉴定的工具有很多,我们认为比较适合大众直接上手使用的软件就是singleR了。那么,singleR到底是如何实现细胞注释的呢?今天,我们就一起...

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  • Seurat Weekly NO.0 || 开刊词

    忘不了你对着屏幕微笑的样子,于是,这里应该有更精彩的故事。我们将见证单细胞技术飞入寻常百姓家的过程,这一路上我想一定有许多的细节,就像某个default参数,被...

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  • Single cell RNA-seq data analysis with Chipster course

    前面我们分享了芬兰CSC的培训课程:Single cell RNA-seq data analysis with R

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  • 单细胞分群后继续分亚群的一些例子

    比如发表在 Nat Med. 2018 Aug; 题目是:Phenotype molding of stromal cells in the lung tumo...

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  • 哇!单细胞测序-配体受体互作分析原来可以这么简单又高大上!

    单细胞转录组测序发展至今,我们发现许多文章的最后一部分都会落到配受体结合,可是如何挑配受体,哪些基因可能是配受体,我一脸懵逼。。。

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  • 单细胞分析十八般武艺8:Garnett

    单细胞初级8讲和高级分析8讲 单细胞分析十八般武艺1:harmony 单细胞分析十八般武艺2:LIGER 单细胞分析十八般武艺3:fastMNN 单细胞分析十八...

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  • Seurat 4.0 ||您的单细胞数据分析工具箱上新啦

    随着单细胞技术的成熟,同一细胞内的信息越来越多被揭晓。在转录组时代,我们说单细胞是一个rna的盒子,细胞类型是基因特异性表达的结果。现在,我们可以说单细胞是中心...

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  • 单细胞转录组数据处理之细胞亚群注释

    因为参数需要自己摸索和调整,所以其实拿到细胞亚群数量是因而而异的,取决于你前面降维的程度,分群的算法和参数。不过最重要的是拿到了不同细胞亚群后需要对它进行命名,...

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  • Seurat2与Seurat3兼容与切换

    在单细胞数据分析时,常常用到Seurat(https://satijalab.org/seurat/install.html)这个R语言包。Seurat 分析流...

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  • 单细胞分析十八般武艺4:velocyto

    单细胞初级8讲和高级分析8讲 单细胞分析十八般武艺1:harmony 单细胞分析十八般武艺2:LIGER 单细胞分析十八般武艺3:fastMNN

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