单细胞+外泌体|解析ER阴性乳腺癌他莫昔芬耐药机制

文章信息

标题：CD63+ Ca-Associated Fibroblasts Confer Tamoxifen Resistance to Breast Cancer Cells through Exosomal miR-22 日期及杂志：Adv. Sci. 2020, 2002518（ IF=15.841 Q1） DOI(url): https://doi.org/10.1002/advs.202002518 作者及单位：Wei Zhang，Cun Zhang* The Fourth Military Medical University

文献概述

• 他莫昔芬依然是ER阳性乳腺癌最有效的治疗方法，但是许多病人对他莫昔芬治疗具有耐药性
• 通过单细胞测序，我们发现CD63+ CAFs细胞亚群可以促进他莫昔芬耐药性
• CD63+ CAFs分泌的miR-22作用于ERa，引起ERa低表达，从而引起耐药
• miRNA-22是通过SFRS1的调节被包裹进外泌体囊泡中
• 最重要的是：作者用实验证明了，CD63中和抗体或肿瘤归巢肽cRGD-miR-22海绵纳米颗粒对CD63+ CAF进行药理学阻断可增强他莫昔芬在乳腺癌中的治疗作用

数据和方法

MMTV-PyMT转基因乳腺癌小鼠模型,6周、8周、10周和12周模拟不同乳腺癌BC阶段

6周到12周MMTV-PyMT小鼠的原发性肿瘤的scRNA-seq数据

主要结果

一、在乳腺癌进展过程中ERa表达缺失与他莫昔芬治疗响应差相关

作者选择MMTV-PyMT小鼠模型来进行相关实验，总共选择了四个时间节点来模拟乳腺癌不同的病理阶段：

• 6-week-old (W6)：hyperplasia
• 8-week-old (W8)：ductal carcinoma in situ
• 10-week-old (W10)：early invasive breast carcinoma
• 12-week-old (W12)：late invasive breast carcinoma

使用他莫昔芬处理，结果显示6周和8周的小鼠对他莫昔芬治疗敏感sensitive，10周和12周的不sensitive。

有报道称 ER𝛼 的表达是他莫昔芬治疗有响应的关键决定因素，因此，我们检测了其在小鼠中的表达情况。我们发现，在6周和8周时ER𝛼有表达，但是在10周和12周时表达下降甚至不表达。

以上说明在肿瘤微环境中存在确切的因素导致在乳腺癌进展过程中调控了ERa的表达，从而引起他莫昔芬的耐药。

二、单细胞测序分析发现CAFs与乳腺癌他莫昔芬治疗响应差相关

对W6-W12 MMTV-PyMT的肿瘤组织进行单细胞测序分析。总共分了11个大类：

• breast cancer cells (i.e.,expressing Epcam; BCs)
• CAFs (i.e., expressing Col1A1, Col3A1,THY1, and FAP)
• natural killer T (NKT) cells
• T cells
• B cells
• vascular endothelial cells (VECs)
• adipocyte stem cells (ASCs)
• adipocytes脂肪细胞
• macrophages (M𝜑)
• dendritic cells
• neutrophils

接着使用R包 genefu来计算ER打分，与之前的发现一致，w6和w8比w10和w12的癌细胞群打分高。

随后，作者绘制了每个亚群的ERa打分，发现CAFs亚群在10周和12周都有ERa表达。这表明CAFs可能参与了肿瘤细胞群中ER𝛼下调的诱导过程。

通过对8周，10周，12周的CAFs的分析，发现CD63在12周的CAFs中显著上调(compare to w8)

ERa阴性的乳腺癌中CD63表达高于ERa阳性

ERa阴性中CAFs浸润打分高于ERa阳性

因此确定是CD63+而不是CD63-的CAFs可以调节乳腺癌中ERa下调和耐药。

那么CD63+的CAFs是如何下调癌细胞中的ERa的呢？

三、CD63+ CAF分泌的miR-22促进他莫昔芬耐药

外泌体是一个纳米级别的囊泡结构，在细胞间通讯起到一个非常重要的作用，因此，我们想知道CD63+CAFs分泌的外泌体是否能够引起癌细胞中ERa的低表达。

首先，分离和提纯来自CAF分泌的外泌体，外泌体的电镜结构：

WB鉴定外泌体中包含的蛋白：

使用 CAF-derived exosomes治疗ER𝛼-positive乳腺癌，观察到 CD63+ CAF-derived exosomes可以诱导ERa的下调。

• CD63+ CAFs：CD63+ CAF-exo，实验组
• CD63+-depleted CAF-derived exosomes：CD63+d CAF-exo，对照组

那么是CD63+ CAF分泌的外泌体中的什么导致了癌细胞ERa的低表达呢？

由于外泌体中miRNA含量非常丰富，并且外泌体介导的miRNA传递被广泛认为有助于许多癌症的耐药。

因此，我们想知道是否CD63+ CAFs来源的外泌体mirna可诱导BCs ER𝛼下调。

设计实验如下：

• 1.敲除 CD63+ CAFs和CD63+-depleted CAFs中的一个蛋白：Dicer酶，次酶是miRNA合成过程必须的一个酶。
• 2.使用上面处理过的CAFs处理ER𝛼-positive BCs
• 结果表明ER𝛼-positive BCs中的ERa表达并没降低
• 结果说明 CD63+ CAFs主要通过外泌体中的miRNA诱导ERa的下调

接下来定位外泌体中具体的miRNA，实验设计如下：

• miRNA-seq：CD63+ CAFs 外泌体 vs CD63+-depleted CAFs
• 差异分析：top miRNAs (fold change > 2) were selected

• miRNA靶基因预测：TargetScan，靶向3′UTR of human ER𝛼 mRNA，筛选到 three candidates (miR-22, miR-148a, miR-152-3p)
• 确定miR-22，是 CD63+ CAF-derived的外泌体中最多的miRNA

随后的实验证明：肿瘤中的miR-22是从CAFs分泌的外泌体中内吞摄取的：miR-22 is transferred from CD63+ CAFs to BCs via exosomes

最后研究了miRNA-22作用的具体分子机制：ESR1是miRNA-22的靶基因

ESR1 癌基因 - 癌症123. 雌激素受体α（ERα），也称为NR3A1（核受体亚家族3，A组，成员1），是雌激素受体的两种主要类型之一，雌激素受体是由性激素雌激素激活的核受体。. 在人类中，ERα由基因ESR1（雌激素受体1）编码

这个文章后面还做了非常多详细的实验机理分析，甚至做到了miRNA-22是如何被包裹进外泌体然后运输到肿瘤细胞中去的，甚至做了包裹着miRNA-22的纳米颗粒：cRGD-miR-22-sponge nanoparticles，在小鼠身上验证了可以加强他莫昔芬的治疗响应。