技术分享 | 高灵敏度空间转录组分析

研究背景

单细胞测序技术在生物医药上有着广泛的应用，但由于技术本身的限制，在单细胞分离过程中丢失了细胞的空间位置信息，所以在一定程度上限制了此技术的应用；目前，多种空间转录组学方法的问世，在一定程度上改变了这种情况；2019年，一种基于测序的空间转录组技术——Slide-seq由Fei Chen和Evan Z. Macosko开发，这种技术是将组织中的RNA转移至表面注释有位置信息的珠上，通过测序可以推测出RNA的空间位置，但是，这种技术的检测灵敏度相对较低，在一定程度上限制了该技术的广泛应用。

简介

本文作者主要介绍了基于Slide-seq优化升级的Slide-seqV2，文章中介绍：相对于上一代技术，Slide-seqV2在文库生成，磁珠合成和阵列索引等步骤有相应的优化升级，使RNA捕获效率达到单细胞RNA-seq数据的约50％（约为上一代Slide-seq的10倍），基本接近基于液滴的单细胞RNA-seq（Droplet-based single-cell RNA-seq）技术的检测效率。作者尝试使用Slide-seqV2解决多种生物学问题，证明了Slide-seqV2具有高检测效率和近细胞分辨率，使得该技术有着更广泛的应用场景。

图1 Slide-seq技术概览

优化与改进

1barcode珠的合成优化&阵列测序的流程优化

作者应用边连接边测序的方法：使用单碱基编码方案对barcode珠阵列进行空间索引，通过边连接边测序，并使用偏移引物进行顺序解码。改进后的方法优势在于，barcode解码更兼容已经商业化的测序仪。另外作者改进了barcode珠的合成方法，使得该珠子更适配新的解码方法，且错误率更低。从而使测序文库的barcode与芯片上的barcode能够更好的对应起来，增加了有效数据的比例。

图2 基于连接进行单碱基测序

2cDNA合成方式优化

作者假设：由于组织对逆转录过程起到抑制作用，模板转换反应（为转录组3’端添加扩增位点）效率降低；所以，作者在逆转录后增加了第二链合成步骤，让更多的cDNA变得可扩增。

实验验证

作者在12.5天小鼠胚胎上对上述假设进行验证，结果表明：Slide-seqV2的UMI per bead比Slide-seq版本提高了约9.3倍；作者在成年小鼠海马体也观察到了类似的提升（Slide-seqV2：Slide-seq=8.9:1）。

图3 小鼠胚胎切片上每个珠UMIs/bead数量直方图

作者通过与其他检测细胞和组织中RNA含量的分子技术进行对比分析，尝试对Slide-seqV2的绝对灵敏度进行定量。在相同的细胞数量中，作者对通过Slide-seqV2，Drop-seq，和单分子荧光原位杂交（single-molecule fluorescence in situ hybridization，smFISH）三种方法检测得到的CA1 marker基因（Atp2b1，Ocaid2和Slc17a7）进行计数统计，三组数据比较结果表明，Slide-seqV2与smFISH的数据更为类似。另外，作者将Drop-seq数据中CA1检测到的每个基因的UMI分别进行计数，同时将Slide-seqV2中鉴定为CA1细胞区域的UMI进行计数统计，比较分析得到的两组数据，Slide-seqV2 检测得到的UMI数约为Drop-seq检测得到的UMI数的44％±26％(median ± median absolute deviation)，即说明Slide-seqV2基因捕获效率基本接近基于液滴的Drop-seq。几组重复的测试结果也表明，Slide-seqV2具有较好的重复性。

图4 海马体Marker基因的图像对比

左: Slide-seqV2 右：HCR FISH图像

1应用Slide-seqV2揭示树突富集mRNA的空间模式

神经元将特定的mRNA主动转运至树突和突触后致密物，它们在突触发育和弹性中起关键作用；以往的研究通过物理显微解剖或细胞培养探索了树突状细胞的富集，但还没有系统地确定树突状细胞定位转录本在原位的分布，树突mRNA仅占神经元转录本的极小一部分，需要更高灵敏度的方法进行检测；

作者使用Slide-seqV2检测和识别了小鼠海马神经元中树状定位的mRNA，对得到的Slide-seqV2数据进行差异表达分析，并结合前期小鼠海马神经元scRNA-seq数据，过滤后得到213条重要基因，这些基因与之前两项类似研究的结果高度重合。

图5 Slide-seqV2揭示了树突状富集的mRNA的空间模式

2应用Slide-seqV2建立了发育中的小鼠皮质的空间发育轨迹

在发育过程中，基因表达随时间和空间的动态变化有助于产生复杂的组织结构和终末分化的细胞类型。最近，一种称为RNA velocity的数据计算策略被提出，该方法通过每个基因的剪接和未剪接转录本的相对数量动态地模拟表达轨迹，作者受上述方法的启发，将Slide-seqV2数据的空间信息与单细胞轨迹分析工具整合在一起，以表征小鼠新皮层的时空发育，从而可以鉴定出因Slide-seq采样不足而遗漏的潜在遗传程序。

作者利用Slide-seqV2空间维度系统地鉴定非随机空间基因表达模式，在发育中的新皮层中鉴定了1,349个空间变化的基因（P <0.005），包括Sema5b和Nrp1，它们编码参与轴突引导的蛋白质，且这些基因与空间LT（latent time）轴密切相关，此外，在整个表达水平范围内，1,043个基因与通过轨迹推断法鉴定的基因高度重叠。

图6 slide-seqV2重建发育中的小鼠皮层的空间发育轨迹

研究结论

作者描述了高分辨率空间基因组学Slide-seqV2，该技术的灵敏度比原始Slide-seq高出近一个数量级。另外，作者展示了Slide-seqV2更高的捕获效率，这极大地扩展了数据可能的分析范围，包括发现具有不同亚细胞定位模式的基因以及通过空间追踪命运指定中涉及的发育程序，将为研究个体发育、疾病发生等问题提供有力的技术支撑。

参考文献

Stickels, R.R., Murray, E., Kumar, P. et al. Highly sensitive spatial transcriptomics at near-cellular resolution with Slide-seqV2. Nat Biotechnol (2020).