细胞相互作用在单细胞转录组中的应用（一）

前言

许多生物进程和细胞通讯息息相关，如胚胎发育，器官形成，癌症发生发展，炎症反应，药物作用和耐药研究等。当细胞不能正确地相互作用或不正确地解码分子信息时，就会引起疾病。因此，细胞间信号通路的鉴定和定量已成为跨不同学科进行的常见分析。蛋白质间的相互作用数据库的扩展以及RNA测序技术的最新进展，使从大量和单细胞数据集的基因表达测量中进行细胞间信号传导的常规分析成为了可能。特别是，配体-受体对可用于从其同源基因的协调表达中推断细胞间的通讯。

细胞相互作用类型

细胞互作的类型主要包含四类，分别是自分泌、旁分泌、近分泌和内分泌。自分泌信号转导是指细胞内通讯，细胞分泌配体，这些配体用于通过同源受体诱导同一细胞上表达的那些分子的细胞应答；旁分泌细胞间的通讯不需要细胞间的接触，而是取决于信号分子在分泌后从一个细胞扩散到另一个细胞；近分泌依赖于接触的细胞间通讯依赖于间隙连接或膜纳米管等其他结构，使信号分子直接在细胞之间传递，而不会分泌到细胞外；内分泌细胞间的通讯代表细胞间的通讯，信号分子被分泌并通过诸如血浆的细胞外液传播很长一段距离。

细胞相互作用分析一般流程

细胞相互作用分析流程主要包括以下几步：收集样本组织、制备单细胞悬液、建库和测序；对原始数据预处理获得基因表达矩阵；结合受配体数据库，保留矩阵中的配体或受体相关基因；对配体和受体之间的相互作用进行打分；可视化相互作用；对预测的配受体互作对进行验证。

细胞相互作用工具

目前，关于细胞相互作用分析的工具已经有很多，今天小编主要为大家介绍cellphoneDB和CellChat这两款软件。

1. cellphoneDB

简介

cellphoneDB包含配体、受体及其相互作用的数据库，共有978个蛋白，1396对相互作用基因对。目前，已经开发了的几种从scRNA-seq数据推断细胞之间的通信的方法，例如SingleCellsignalR, iTALK和NicheNet，主要关注点是单一的配体受体，而事实上很多生物学功能是基于受体复合体，而cellphoneDB考虑了配体和受体的结构组成，能够准确地描述异聚复合物。

分析原理

1. 计算互作强度

以细胞群为相互作用的对象，计算受配体在每个细胞群的平均表达量，然后计算两个细胞群之间受配体的平均表达量作为相互作用的指标。不同于之前的其他相互作用分析方法，cellphoneDB考虑蛋白复合体的情况，例如受体如果有两个亚基Sub.1和Sub.2，取表达量较低的亚基作为受体的表达量。

2. 计算互作显著性

cellphoneDB用置换检验计算某一对相互作用的P值。随机打乱细胞类型标签，计算相互作用平均表达量；重复1000次，得到平均表达量的分布；如果用鉴定细胞类型计算的平均表达量较高，大于分布的top50，那么我们可以认为这一对相互作用的P值小于50/1000=0.05。

可视化展示

应用

案例1

2020年10月，武汉协和医院陈朝晖教授与谌科教授于Nature Communications（影响因子：12.121）在线发表了膀胱癌单细胞测序的最新研究成果（Single-cell RNA sequencing highlights the role of inflammatory cancer-associated fibroblasts in bladder urothelial carcinoma）。该文章对8例膀胱癌肿瘤样本和3例配对癌旁样本进行了高通量单细胞转录组测序，绘制了膀胱癌肿瘤微环境细胞图谱，通过细胞互作分析强调了肿瘤相关成纤维中iCAFs亚群的作用并提出了膀胱癌治疗的潜在靶点。

案例2

2019年9月，Stewart 等人于国际学术期刊Science上绘制了人类肾脏的时空性免疫分区图谱（Spatiotemporal immune zonation of the human kidney），该文章使用细胞间相互作用分析方法有助于揭示上皮免疫系统的串扰，从而协调抗菌巨噬细胞和嗜中性粒细胞向肾脏最易感染区域的富集。

2. CellChat

简介

CellChat能够从单细胞RNA测序（scRNA-seq）数据定量推断和分析细胞间通讯网络；它整合了相互作用数据库，包括229 个信号通路，并将信号通路分成三大部分：Cell-Cell Contact、ECM-Receptor、Secreted Signaling；可视化效果较好。

原理

主要步骤：

1.计算基因在细胞类型中的加权平均表达量，减弱极值影响：

注：Q1,2,3是一个基因在一个细胞群中表达分布的四分位点；

2.计算相互作用基因pairs：

注：i：细胞群ID；

LA：共激活配体；

LI：共抑制配体；

Li,1 … Li,m1: 配体亚基。如果有一个亚基的表达量等于0，那么配体Li 的表达量等于0，这跟cellphoneDB的思想类似；Li 的表达量跟LA正相关，LI负相关；Rj的计算方法跟L一样。

注：希尔方程的微观解离常数Kh默认取0.5；

AG(agonist,促进剂)；

AN(antagonist,拮抗剂)；

ni/nj/n(分别是细胞群i/j的细胞数和样本总细胞数)；

两个细胞群i, j之间的基因对k的相互作用强度P，综合考虑了受配体（LR）/拮抗蛋白/促进蛋白的相互作用位点的饱和度，还有细胞比例。这里的希尔方程系数为1（非协同反应）。

3.检验。Permutation test (L= 100 by default)

可视化展示

应用

案例

2020年7月，Suoqin等人开发了CellChat，该软件在小鼠胚胎发育和成年伤口愈合的小鼠皮肤scRNA-seq数据集上的应用表明，它具有提取复杂信号模式的能力。

总结

每一种推断细胞相互作用的方法都有自己的假设和局限性需要考虑。cellphoneDB和CellChat等工具用细胞类型作为研究对象，而实际组织中的细胞相互作用是以细胞为单位的，同种细胞类型，分散的部位，可能有不同的相互作用。因此，在使用这些策略时，重要的是要了解这些优势和劣势，并选择适当的参数进行分析。

参考文献

1.Armingol E , Officer A , Harismendy O , et al. Deciphering cell–cell interactions and communication from gene expression[J]. Nature Reviews Genetics, 2020.

2.Efremova M , Vento-Tormo M , Teichmann S A , et al. CellPhoneDB: inferring cell–cell communication from combined expression of multi-subunit ligand–receptor complexes[J]. Nature Protocols.

3.Braga F A V , Kar G , Berg M , et al. A cellular census of human lungs identifies novel cell states in health and in asthma[J]. Nature medicine, 2019, 25(7).

4.Chen Z , Zhou L , Liu L , et al. Single-cell RNA sequencing highlights the role of inflammatory cancer-associated fibroblasts in bladder urothelial carcinoma[J]. Nature Communications.

5.Spatiotemporal immune zonation of the human kidney[J]. Science, 2019, 365(6460):1461-1466.

6.Suoqin Jin, Christian F. Guerrero-Juarez, Lihua Zhang, Ivan Chang, Peggy Myung, Maksim V. Plikus, Qing Nie. Inference and analysis of cell-cell communication using CellChat. bioRxiv 2020.07.21.214387