三代测序与单细胞转录组

单细胞转录组测序通常是基于二代测序平台，具有相对较低的成本和高通量的优势。由于二代测序建库过程需要对cDNA进行打断，无法同时获得细胞标签和全长转录组数据，所以对单细胞转录本的变化知之甚少。而三代测序可以获得全长转录组数据，对于挖掘新转录本以及isoform有着重要的意义。

三代测序是指单分子测序技术，在测序过程中，不需要经过PCR扩增，实现了对每一条DNA分子的单独测序。目前主流的三代测序平台有PacBio公司的SMRT和Oxford Nanopore Technologies纳米孔单分子测序技术（有时候也称作四代）。与二代测序相比，三代测序的优势主要有以下几点：1.直接对原始DNA样本进行测序，测序过程中不需要PCR扩增，因此可以避免潜在的PCR扩增错误和偏好性；2.读长较长，如PacBio 平台平均读长达到10Kb；3.有的平台（Oxford Nanopore Technologies）可以直接测RNA序列，降低了体外逆转录和文库构建过程产生的系统误差；4.可以直接测甲基化的DNA序列。同时，三代测序技术也存在一些缺点，比如三代测序依赖DNA聚合酶的活性；测序成本很高而且错误率较高（大约在15%-40%）。

三代测序与单细胞转录组结合会解决二代测序转录组读长较短和无法获取全长转录本数据的局限性，可以将单细胞水平的研究变得更加“精细”。

2020年7月中山大学肖传乐老师发表题为“HIT-scISOseq: High-throughput and High-accuracy Single-cell full-length Isoform Sequencing for Corneal Epithelium”的研究论文，介绍了一种三代单细胞转录组测序技术-HIT-scISOseq（High-throughput single-cell isoform sequencing）。作者将cDNA分子首尾相连，使片段长度提高了3~5倍，然后进行SMRT 建库和 Pacbio 测序（如下图）。该方法可以从更少的reads中获得更多的转录本。作者通过HIT-scISOseq构建了4000个正常和8000个受伤的猕猴角膜上皮细胞的全长转录组图谱，找到了新的异构体，并确定了与损伤相关的转录本剪切和转换机制。

2020年8月Kevin Lebrigand发表了一篇题为“High throughput error corrected Nanopore single cell transcriptome sequencing”的研究论文，将单细胞转录组测序和Nanopore测序结合开发了ScNaUmi-seq (Single-cell Nanopore sequencing with UMIs)技术。具体是将Nanopore测序技术与UMI以及单细胞测序单细胞分离系统相结合，以获得经过纠错的全长序列信息。文中指出cellBC和UMI指定的Nanopore数据集很好地代表了单细胞测序方法中捕获的转录组。研究者通过对相同UMI的reads进行分组，来纠正Nanopore测序错误，在单个细胞内识别序列异质性，通过对中枢神经系统中Gria2校正后的一致性序列分析，揭示了一个位点的编辑增加了另一个位点被编辑的可能性。

2020年12月30日，北京大学未来基因诊断高精尖创新中心、生物医学前沿创新中心汤富酬课题组在Plos Biology上在线发表了题为“Single-cell RNA-seq analysis of mouse preimplantation embryos by third-generation sequencing”的研究论文。作者开发了一种基于Nanopore测序平台单细胞转录组测序方法—SCAN-seq ，在53个小鼠胚胎干细胞（mESCs）和200多个小鼠植入前胚胎细胞中分别鉴定出6,487条和27,250种新转录本。胚胎干细胞所有样本中共检测到6,487个无注释的转录本，并且SCAN-seq能够区分新找到的转录本是来自同一已知转录本的新转录本，还是来自不同已知转录本已注释剪接点的重新组合的新转录本。

展望

三代检测的全长转录本有着比二代测序更多的应用场景：检测isoform在不同细胞中的差异；区分每个基因的所有不同可变剪接产物；检测全长转录本的SNV；发现更多转录本融合情况；检测全长BCR和TCR序列等。相信随着三代测序准确度的提高、成本的下降以及生信分析的越来越完善，三代测序将会有更多的有待开发的应用场景。

参考文献

1. Ying-Feng Zheng, Zhi-Chao Chen 2, Zhuo-XingShi, et al. HIT-scISOseq: High-throughput and High-accuracy Single-cell Full-length Isoform Sequencing for Corneal Epithelium. BioRxiv 222349.

2. Lebrigand K, Magnone V, Barbry P, Waldmann R. High throughput error corrected Nanopore single cell transcriptome sequencing. Nat Commun. 2020;11(1):4025. Published 2020 Aug 12.

3. Fan X, Tang D, Liao Y, et al. Single-cell RNA-seq analysis of mouse preimplantation embryos by third-generation sequencing. PLoS Biol. 2020;18(12):e3001017. Published 2020 Dec 30.

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