单细胞专题 | 1.单细胞测序(10×genomics技术)的原理 单细胞专题 | 2.如何开始单细胞RNASeq数据分析 单细胞专题 | 3.单细胞转录组的上游分析-从BCL到FASTQ 单细胞专题 | 4.单细胞转录组的上游分析-从SRA到FASTQ 单细胞专题 | 5.单细胞转录组的上游分析-从FASTQ到count矩阵 单细胞专题 | 6.单细胞下游分析——不同类型的数据读入 单细胞专题 | 7.单细胞下游分析——常规分析流程案例一 单细胞专题 | 8.单细胞类型注释之SingleR包详解
单细胞人工注释依赖于marker gene的调查,简单来说,就是收集各种细胞类型的标志物,根据标志物在不同细胞亚群中的表达来判断细胞类型。细胞标志物的收集可以来源于文献或者数据库。
下面这些是一些来自文献的标志物信息
文献:Acquired cancer resistance to combination immunotherapy from transcriptional loss of class I HLA
再比如2018年发表于science杂志的文章就是自己根据文献进行整理的:Single-cell transcriptomes from human kidneys reveal the cellular identity of renal tumors.
再如:人肾脏组织主要细胞类型marker基因列表(data from CellMarker)
panglaodb:https://panglaodb.se/index.html
CellMarker :http://xteam.xbio.top/CellMarker/index.jsp
我们继续以我们前面的文章保存的数据为例:
library(SingleR)
library(Seurat)
setwd("H:/MedBioInfoCloud/analysis/scRNAseq/BLCA/GSE130001/")
load('data/sce.output.merge.GSE130001.Rdata')
我们从CellMarker 数据库中查看膀胱组织中的标志物信息:
可视化这些基因在不同亚群中的表达:
genes_to_check <- c("ALDH1",
"CD133", "OCT4",
"CD133",
"CD24", "CD44", "CD47",
"CD44v6","EMA",
"SOX2",
"CD34",
"EMA",
"N-cadherin",
"UGP85",
"CD44", "CK20", "CK5")
library(stringr)
library(ggplot2)
genes_to_check = unique(intersect(rownames(sce),genes_to_check))
genes_to_check
P13 <- DotPlot(sce, features = genes_to_check,
assay='RNA' ) + coord_flip()
P14 <- VlnPlot(object = sce, features =genes_to_check,log =T )
P15 <- FeaturePlot(object = sce, features=genes_to_check )
ggsave(filename = "data/mk.pdf",P13/P14/P15,height = 15,width = 10)
上次singleR注释的结果:
根据标志物的表达情况,首先,可以很确定的是第8个细胞亚群为Endothelial cell。因为Endothelial cell的标志物是CD34,但是这个正常的膀胱组织细胞类型,这个也很正常,取的肿瘤组织(CD45-),含有个别正常细胞正常。其他的大部分类群都是Bladder Cancer 细胞。但是上次使用singleR注释时,第12个亚群是NK细胞,查看一下CD45的表达。
MedBioInfoCloud: DotPlot(sce, features = "CD45",
+ assay='RNA' )
Error in FetchData.Seurat(object = object, vars = features, cells = cells) :
None of the requested variables were found: CD45
CD45在数据质控的时候已经被过滤掉了【本身样本CD45阴性】,作者文章也说有了,有CD45阴性的免疫细胞。所以我个人觉得可以将12这个细胞类群删除,用于后续的分析。
这里我们就暂且按照注释的细胞重新命名一下就行了:
###直接修改类群的值
sce3 <- sce
new.cluster.ids <- c(rep("Bladder Cancer",8),"Endothelial cell",rep("Bladder Cancer",4))
names(new.cluster.ids) <- levels(sce3)
sce3 <- RenameIdents(sce3, new.cluster.ids)
DimPlot(sce3, reduction = "tsne", label = TRUE, pt.size = 0.5) + NoLegend()
相对来说,该数据集中是流式筛选后测序的数据,所以这里的注释还是可靠的,后续的分析可以结合SingleR包注释的结果和人工审核的结果一起判断,用于后续的分析,这里可以只选择上皮细胞进行后续的分析,因为这个类群是很确定的癌细胞。下面这个图是来自一篇使用了该数据集的一篇生信文章【PMID:35769986】中的结果图,作者使用的是SingleR包注释,也的确有NK细胞,但它的过滤条件和我这里教程的不一样,作者还融合了其他数据集。但整体上来说,自己注释的方法就是这么一个流程。
总之,人工注释依赖于自己的知识背景和marker基因的收集。实际上我做的大量肿瘤单细胞数据分析项目里面,需要有一些背景知识哦!比如背诵如下所示各个细胞亚群高表达量基因的列表:
# T Cells (CD3D, CD3E, CD8A),
# B cells (CD19, CD79A, MS4A1 [CD20]),
# Plasma cells (IGHG1, MZB1, SDC1, CD79A),
# Monocytes and macrophages (CD68, CD163, CD14),
# NK Cells (FGFBP2, FCG3RA, CX3CR1),
# Photoreceptor cells (RCVRN),
# Fibroblasts (FGF7, MME),
# Endothelial cells (PECAM1, VWF).
# epi or tumor (EPCAM, KRT19, PROM1, ALDH1A1, CD24).
# immune (CD45+,PTPRC), epithelial/cancer (EpCAM+,EPCAM),
# stromal (CD10+,MME,fibo or CD31+,PECAM1,endo)
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