单细胞RNA-seq分析小鼠肺动脉高压内皮细胞

文章信息

标题： Single-cell RNA sequencing profiling of mouse endothelial cells in response to pulmonary arterial hypertension 日期: 2022-10 DOI:https://doi.org/10.1093/cvr/cvac147 GSE数据库编号：GSE154959

文献概述

问题：内皮细胞功能障碍驱动肺动脉高压（PAH）的发生和发病机制。

方法：3个对照：3个造模组。

结果：小鼠特殊造模进行单细胞数据分析，并对不同内皮细胞进行细分得到相应的七个主要肺内皮亚型（动脉，静脉，毛细血管A，毛细血管B，淋巴管，增殖和“Sftp”） 。基于SCrna-seq和BulkRNA-seq两种分析得出抗原加工和呈递该通路中在肺高压造模小鼠的血管相关亚群细胞的特异性。后续确定毛细内皮B亚群对于细胞凋亡、迁移和血管生成基因有关也侧面证明了该亚群在肺高压疾病中的特殊性确定了一些特异性基因（Aqp1，Cav1，Bmpr2, Eng）并推断在人与大鼠中是否也具有特异性。进一步分析血管相关亚群探究确定了一个动静脉轴的差异变化确定了某些基因（Sgk1, Cd34, Sparc, Sparcl1）在疾病中对于动静脉轴的一个影响作用。

实验结果

小鼠肺部的 scRNA-seq 分析

文章先基于特殊的细胞筛选保留了内皮细胞然后进行分群注释可以看出大部分保留下来为内皮细胞。根据文章中展示的标志基因也可以看出八个亚群中4，6两个亚群不算是内皮细胞是非EC污染亚群。

肺EC亚群的鉴定

对于内皮细胞亚群的鉴定先选择三个对照组织肺内皮细胞进行注释。大多数内皮细胞被识别为毛细血管A，主要为 Nrp1 和 Sema3c 高表达。毛细血管B主要是 Car4 表达。根据血管标志物（ Vwf 和 Vcam1 ）和特异性基因确定静脉（ Vwf 表达较高， Prss23 特异性表达）和动脉内皮亚群（ Cxcl12 和 Mgp 特异性表达）。淋巴管内皮标志物（ Ccl21a 和 Prox1 ）。此外还有一个增殖亚群和一小部分具有高表面活性蛋白基因（ Sftpa1、Sftpb、Sftpc 和 Sftpd ）表达的亚群。

两组细胞亚群之间的差异

为了确定EC亚群中PAH介导的转录变化，整合了所有样本，推断比例变化各个亚群的细胞比例变化没有明显变化。

对主要的内皮亚群中进行了差异基因表达分析，以确定PAH影响的某些变化。观察到与静脉和淋巴EC相比，动脉，毛细血管A和毛细血管B 内皮细胞中的差异基因数量更多，也可以确定产生变化的基因通常在动脉、毛细血管和静脉 内皮细胞中。

差异基因的富集与特异性亚群

对各个亚群的DEG进行了KEGG通路富集分析确定了一条与抗原加工和呈递途径。并确定毛细血管B亚群的某些基因在PAH模型组的的高表达。

PAH对毛细血管B中通路的调控

为了探究PAH介导的毛细血管B内皮特异性基因，对该亚群的特异基因进行富集。发现这些基因会参与调控定位和细胞死亡两种通路。分析了参与细胞凋亡的正负调节通路。观察到PAH中阳性和阴性凋亡相关调节基因的表达均增加，可能反映肺高压后毛细血管B细胞亚群细胞凋亡的持续调节。同时促凋亡调节因子Bax在肺高压的毛细血管B亚群中显著上调也可以侧面证明该亚群在凋亡途径的特异性。

同样文章还观察到毛细血管B 内皮细胞中血管生成调节因子更高表达，PAH组的表达高于对照组。表明，血管生成调节途径在毛细血管B 内皮细胞中被激活，在PAH中增强。

综上PAH会介导毛细血管B 内皮细胞中凋亡，促迁移和促血管生成等通路的调节。

PAH在大鼠和人PAH中是否具有相同作用

为了评估数据集是否在人类PAH中具有相同作用，根据BulkRNA-seq从PAH鉴定出四个基因：（ Aqp1 ， Cav1 ， Bmpr2 和 Eng ）。Aqp1 与 Cav1 上调基因，而 Bmpr2 和 Eng 作为下调基因。

文章还在大鼠和人类scRNA-seq数据集中进行补充验证。为了比较PAH诱导的跨物种内皮细胞影响，对大鼠PAH和对照组和人类数据进行了四个血管EC亚群（动脉，静脉，毛细血管A和毛细血管B）的差异表达分析。总体而言，51%的上调小鼠基因（14%的小鼠下调基因）在大鼠或人类中也存在差异表达，并确定三个（ Cd74，Sparc，Slc6a6 ）和五个（ Sparc，Cd81，Anxa2，Id3，Slc9a3r2 ）基因分别在小鼠，大鼠和人动脉和毛细血管A 内皮细胞中上下调。除 CD74 外，MHC-II复合体中的基因（HLA基因）在人类IPAH中也上调，表明该途径的特异性。

为了确定已确定靶标的功能相关性，文章选择 CD74 ，因为它在PAH中小鼠血管内皮中的全局改变及其在大鼠和人类数据集中的特异。通过先前研究人 IPAH 组织的免疫染色和分离的 IPAH 内皮细胞的蛋白质印迹，IPAH 内皮细胞中的 CD74 蛋白水平升高。此外， CD74 有助于体外将外周血单核细胞募集到肺EC中，支持CD74/MHC-II复合体对疾病的影响。由于 CD74 还影响其他细胞类型中不同的作用，这些结果显示了 CD74 对内皮细胞功能的重要作用。

绘制PAH中动静脉轴上的转录组变化

从中所示的 UMAP 可视化，我们观察到动脉和静脉EC簇通过毛细血管A内皮的两侧，作为一个连续的肺血管结构。为了研究跨动静脉轴的内皮细胞变化，文章使用Slingshot进行拟时序分析。细胞沿动静脉轴根据静脉、毛细血管A和动脉标志物（ Prss23、Sema3c 和 Cxcl12 ）表达从而确认沿脉管系统的表达梯度变化。

随后文章沿该轴对10个切片进行差异基因表达分析，鉴定33个DEG，静脉轴区域的DEG数量较少。该分析揭示了分区依赖性变化， Sgk1 和 Cd34 基因在毛细血管和动脉 EC 之间的交界处显示出上调峰。自分泌蛋白酸性和富含半胱氨酸（SPARC）蛋白家族的两个基因也表现出不同的表达谱， Sparc 在动脉EC中上调， Sparcl1 在微脉管系统中上调.

结论

文章主要肺高压小鼠的内皮细胞进行分析。主要针对内皮细胞中的血管相关亚群。

根据血管亚群的差异分析综合差异基因的表达确定抗原呈递通路，(MHC-II)及Cd74相关基因在肺高压疾病中的作用。

毛细血管B内皮细胞中促迁移，细胞凋亡和促血管生成等基因通路中的基因的特异性上调。

最后观察疾病对于动脉静脉轴中血管与血管之间的作用进行了分析。

我个人看着文章做的人类中的CD74有关表达也不算是特别高。

文献阅读感想

文献中主要针对与内皮细胞进行分析针对于血管内皮与疾病的关系进行探索。

文献给出了所有亚群的标志基因，更直观的观察各个亚群（对于内皮细胞的血管内皮细分）。

我个人觉得细胞比例差异没有多大变化但是亚群里面差异基因数量还可以，可能是该疾病主要是对于基因方面变化？

单细胞数据只是根据各个亚群中的某些特定基因进行分析，没有做更深层次的分析。也没有探究亚群与亚群之间的关系像内皮细胞与那种特定免疫细胞的关系？

文章的内容基础流程很完善，进行复现的时候也是可以复现出来的。附图中也有大量的数据分析，整体工作探究内皮细胞亚群的差异基因表达，我个人认为文章整体还是比较不错的。有兴趣的同学可以读一下。