基因敲除前后的单细胞转录组已经成为了标配了吗

探索一个基因的功能，比如它在不同细胞系的表达量情况，在病人样品表达量情况，是否影响肿瘤的发生发展，转移复发耐药等等，这方面湿实验手段非常多，有：

• RNA extraction, reverse transcription and real-time RT-PCR
• Western blot analysis
• Immunohistochemistry assay (IHC)
• CCK-8 assay, clone-formation assay and EdU assay
• Wound-healing assay
• Migration and invasion assays
• Conditioned medium collection
• Xenograft tumour models and metastasis models
• Luciferase reporter assay

如果收集病人队列比较麻烦，细胞系实验比较大众，也可以从数据分析角度探索一个基因的功能，有：

• 表达量相关性
• 干扰前后表达量差异分析

虽然说生命科学领域的中心法则是从DNA到RNA到蛋白质，理论上都是可以研究的对象，但是目前了转录组层面的表达量深入人心，包括最开始的基因表达量芯片，后来的转录组测序，以及现在流行的单细胞转录组。

找到一个感兴趣的基因并不难，后续的湿实验的探索也是绝大部分科研实验室的标配，但是后面的干扰前后表达量差异分析随着技术的进步在一步步升级了，目前大家肯定是买不到表达量芯片了，普通的bulk转录组测序四五百块钱一个样品，非常容易做一次3 vs 3 的差异分析。为了显得与众不同，目前基因敲除前后的单细胞转录组快渐渐地成为了标配。

单细胞的多组对照设计（例如正常组与给药组）可以为细胞类型水平比较提供以往Bulk RNA-seq分析所不能达到的精度。对此一般有两种进阶分析思路：

• （1）DE(Differential expression)--两组样本的同一细胞类型的基因表达差异分析；
• （2）DA(Differential abundance)--两组样本的同一细胞类型的丰度差异分析

参考：http://bioconductor.org/books/release/OSCA/overview.html

比如2022的文章《Single cell sequencing reveals that CD39 inhibition mediates changes to the tumor microenvironment》，就是通过数据分析定位到了 CD39 这个基因，所以后续就干扰它，干扰前后看看细胞比例的变化以及表达量的变化：

干扰 CD39 这个基因

再比如2022的文章《Integrated Multi-Omics Landscape of Liver Metastases》，也是通过前面的数据分析定位到了SLC2A1这个基因，然后就干扰它，干扰前后看看细胞比例的变化以及表达量的变化：

干扰SLC2A1这个基因

单细胞转录组数据分析里面最基础的往往是降维聚类分群，参考前面的例子：人人都能学会的单细胞聚类分群注释 ，其实这样的基础认知，也可以看基础10讲：

• 01. 上游分析流程
• 02.课题多少个样品，测序数据量如何
• 03. 过滤不合格细胞和基因（数据质控很重要）
• 04. 过滤线粒体核糖体基因
• 05. 去除细胞效应和基因效应
• 06.单细胞转录组数据的降维聚类分群
• 07.单细胞转录组数据处理之细胞亚群注释
• 08.把拿到的亚群进行更细致的分群
• 09.单细胞转录组数据处理之细胞亚群比例比较

后面的一些可视化（一些基因的表达量小提琴图，细胞比例条形图），我们就直接看学徒的图表复现吧，代码真的是超级简单。