【Cell】R-Loop 从生理到病理

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摘要

DNA-RNA杂交体在细胞过程中起着生理作用，但通常，它们代表的是非计划的共转录结构，对转录、复制和DNA修复产生负面影响。越来越多的证据表明，它们构成了复制应激、DNA断裂和基因组不稳定性的来源。反过来，DNA断裂通过释放双螺旋构象，促进了DNA-RNA杂交体的形成。细胞通过防止或直接清除杂交体，或通过与DNA修复耦合的机制，避免DNA-RNA的积累。鉴于R环对染色质和基因组组织的影响，以及其与遗传疾病的可能关系，我们将对R环的稳态以及其生理和病理角色进行回顾。

R环是在转录过程中形成的非B型DNA结构，当新生的RNA与模板DNA链退火时形成，从而排斥非模板DNA链。R环这个术语指的是由DNA-RNA杂交体和被排斥的单链DNA（ssDNA）形成的三链结构，而DNA-RNA杂交体只指的是双链结构，尽管在许多报告中，这两个术语都被模糊地使用。一般来说，R环在延伸的RNA聚合酶后形成，可以比1 kb更长的结构。R环有两种类型：生理的和病理的。生理R环通常依赖于需要特定因子保证其形成的程序化过程；病理R环偶然地以非预定的方式发生。DNA-RNA杂交体的形成在它们起到生理功能的某些区域特别增强。

然而，人们也在细菌和真核细胞的整个基因组中检测到了杂交体。每个转录单元发生这种情况的频率尚未确定，但很可能太低，不能代表具有全局功能角色的生理结构，而更像是对细胞产生负面影响的意外结构。

总的来说，R环可能干扰DNA的复制、修复和转录，从而威胁基因组的完整性和功能。因此，细胞已经发展出不同的机制来防止或解决这种DNA-RNA杂交体。当这些机制中的任何一个失败时，R环就会对基因组的完整性和细胞增殖构成威胁，成为细胞病理的潜在来源。在这篇文章中，我们回顾了在转录、复制和修复的背景下吸引了人们对R环的关注的相关数据，目的是提供对控制R环稳态的分子机制的当前观点，以及这如何与疾病相关的观点。

R环的分布、长度和频率

研究R环的特性和在基因组中的分布依赖于可用的检测它们的生物工具。已经开发了不同的方法来检测体内的DNA-RNA杂交体，包括分离和物理分析对核酸酶（RNase）A耐受但对RNase H敏感的核酸（Huertas和Aguilera，2003）；电子显微镜（EM）（Backert，2002）或染色质免疫沉淀（ChIP）和/或免疫荧光（IF）使用失活的RNase H（Chen等人，2017；Ginno等人，2012）以及RNase H1杂交结合域（HB）融合到绿色荧光蛋白（GFP）（Bhatia等人，2014）（图1A）。然而，最常用的方法依赖于S9.6抗-10核苷酸DNA-RNA杂交单克隆抗体（Boguslawski等人，1986）（图1A）。这种抗体已被广泛用于DNA-RNA杂交免疫沉淀（DRIP），然后通过在特定DNA区域的qPCR或通过测序进行全基因组研究，以及用于IF。这些分析使我们对沿真核基因组不同区域的杂交体的分布有了相对精确的了解，主要来自酿酒酵母和人类细胞（El Hage等人，2010；Ginno等人，2012；Wahba等人，2011；Sanz等人，2016）。在DRIP和IF试验中，需要用RNase H1处理，它特异性地降解杂交体的RNA部分，因为S9.6抗体也能识别存在于特定位点的高浓度双链RNA（dsRNAs）（Hartono等人，2018；Silva等人，2018）。

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总的来说，最初的全基因组DNA-RNA免疫沉淀(DRIP)分析已经被其他方法所确认并扩展。这些方法包括使用高通量测序对带有dUTP或适配器的DNA库或通过RT-PCR从DNase I处理后的杂交RNA部分获得的cDNA库进行链特异性测序（Nadel等人，2015年；Xu等人，2017年；Sanz等人，2016年）。全基因组分析揭示了在正常/野生型细胞中，R环在比预期更多的DNA区域存在。实际上，基因组覆盖率数据在酵母中为8%，在拟南芥中为10%，在人类细胞中为5%（Wahba等人，2016年；Xu等人，2017年；Sanz等人，2016年）。总的来说，这些数据表明，DNA-RNA杂交体更倾向于在高度转录的基因处积累，包括rRNA和tRNA位点，以及一些转座元件（酵母中的Ty）、着丝点和端粒、反义RNA或ncRNA区域（Chan等人，2014年；Chen等人，2017年；El Hage等人，2014年；Ginno等人，2012年；Wahba等人，2016年）。在酵母中，容易形成R环的开放阅读框（ORFs）通常高度转录，并且GC含量高，但观察到的ORFs的比例根据研究的不同，从20%波动到超过65%（Wahba等人，2016年；El Hage等人，2014年；Chan等人，2014年）。这种变异可能是由于DNA-RNA免疫沉淀协议的技术差异（参见Hala sz等人，2017年）。在哺乳动物细胞的情况下，R环也主要在活跃的基因处被检测到，并且它们也在启动子和终止子区域积累，在这些区域，它们在基因表达调控中发挥作用（Ginno等人，2012年；Sanz等人，2016年）。此外，这些研究允许识别倾向于DNA-RNA杂交的序列，如GC富含序列、CpG岛、具有高GC偏斜的转录终止位点，或包含G四链体（G4）的序列（Ginno等人，2012年；Sanz等人，2016年；Chen等人，2017年；Stork等人，2016年）。尽管对这些特性有一般的共识，但是在使用特定协议时观察到了某些区域。例如，在酵母中，通过DRIP分析结合S1核酸酶消化检测到的容易形成R环的区域主要是AT富含的（Wahba等人，2016年）。然而，在这种情况下，排除S1诱导的切口不利于在DRIP协议期间DNA-RNA退火的可能性是很重要的。

与DNA-RNA杂交体不同，R环的检测依赖于排出的单链DNA(ssDNA)的识别。有多项报告显示，单链DNA结合蛋白RPA结合到被排出的ssDNA（Chaudhuri等人，2004年；Nguyen等人，2018年），这表明我们可以使用抗RPA抗体来检测R环。然而，由于RPA结合到在重塑的双链断裂（DSBs）和复制叉滞后链产生的ssDNA，RPA信号不太可能被明确归因于R环。间接地，通过在单DNA分子中由硫代硫酸钠产生的突变谱，或通过人体激活诱导的胞苷脱氨酶（AID）的体内作用，可以高精度地推断出体内R环（Yu等人，2003年；Gómez-González和Aguilera，2007年）（图1A）。虽然两者都被证明可靠地检测体内R环（Garcia-Pichardo等人，2017年），但只有硫代硫酸钠突变可以提供DNA-RNA杂交体长度的测量，因为体外硫代硫酸钠处理诱导DNA中所有胞苷的脱氨，而体内AID诱导的突变则不那么连续。使用这种方法，非模板ssDNA区域的突变谱可以推断出R环的平均长度，前提是这种谱可以通过RNase H1处理消除。在人类细胞和酵母中获得了一些估计，报道的大小从小于100bp到2kb不等（Garcia-Pichardo等人，2017年；Li和Manley，2005年；Yu等人，2003年）。比较已识别为R环倾向的DNA区域的长度在可用的DRIP-seq实验中表现出两种不同的行为：窄尺寸分布（180-2350bp）或宽尺寸分布（180-22500bp），这取决于在免疫沉淀之前断裂DNA制备的方法。超声波处理产生较短的倾向于形成R环的DNA段，而限制性酶产生长段，可能由于DNA限制性位点的分布更加分散（Hala sz等人，2017年）。重要的是，使用所述方法，我们尚不能确定R环产生的频率，因此我们并没有衡量R环在细胞或特定DNA区域中出现的频率。然而，我们可以断言，R环在保守的基因组区域上共转录，并且可能面临动态转换。因此，为了理解R环分布的生理意义和原因，我们必须考虑不同的转录谱，生长信号和环境条件，细胞周期阶段，或者每个细胞或DNA区域的特定表观遗传特征等其他特征。

具有生理功能的DNA-RNA杂交体

R环是调节基因组动态的几个过程所需的中间体，例如免疫球蛋白(Ig)类切换重组（CSR）（Yu等人，2003年）或CRISPR-Cas9活性，在其中，引导RNA形成DNA-RNA杂交体作为中间体来识别Cas9介导的切割目标（Jinek等人，2012年），或者在线粒体DNA，细菌质粒，和噬菌体ColE1和T4的DNA复制启动中（参见Aguilera和García-Muse，2012年）（图1B）。此外，越来越多的证据表明R环在基因表达中起作用，这一事实由这样的结构富集在基因启动子和终止区域这一事实得到了支持。DNA-RNA杂交体已经与CpG岛的未甲基化状态联系起来，这些岛存在于哺乳动物细胞中许多基因的启动子。计算和实验数据表明，在CpG岛上形成的R环保护这些区域免受DNA甲基化的影响，最终避免转录沉默（Ginno等人，2012年；Grunseich等人，2018年）。这种保护可以通过观察到DNA甲基转移酶1更倾向于结合和甲基化双链DNA，而不是DNA-RNA杂交体（Grunseich等人，2018年）（图1C）来解释。

此外，R环可以引导转录调控因子的结合，如在长非编码RNA（lncRNA）驱动的调控中所描述的（图1C）。因此，在拟南芥中，一组被称为COOLAIR的lncRNA的表达导致FLC基因的沉默。同源结构域蛋白AtNDX通过结合在其启动子处形成的R环的单链DNA来抑制COOLAIR的表达，最终允许FLC基因的转录（Sun等人，2013年）。有趣的是，酵母细胞也通过lncRNA形成R环来响应环境变化，但在这种情况下是为了激活表达（Cloutier等人，2016年）。在人类细胞中，参与细胞和组织完整性的维门蛋白（VIM）基因在不同类型的癌症中的上调是由于一个lncRNA，VIM-AS1，的反义转录，在VIM启动子区域和转录起始位点（TSS）形成R环，有利于转录因子的募集。消耗VIM-AS1或通过RNase H过表达来破坏R环会使VIM表达失活（Boque-Sastre等人，2015年）。类似地，反义lncRNA TARID也形成了一个R环，该R环调控基因表达。在这种情况下，TARID位于肿瘤抑制基因TCF21的启动子区域，而应激反应蛋白GADD45A结合到这个R环，并招募甲基胞嘧啶双氧酶TET1，导致局部去甲基化和基因转录（Arab等人，2019年）。

除了在人类基因的启动子中定位外，R环在富含G的终止元素上富集。这些将有助于RNA聚合酶II（RNAPII）在有效终止前暂停（图1C）。SETX解旋酶可能在基因poly(A)信号的下游定位的这些R环上起作用（Skourti-Stathaki等人，2011年），在这里，SETX似乎与被招募到RNAPII的二甲基化CTD的Tudor结构域蛋白SMN一起行动（Zhao等人，2016年）。去除这些R环允许Xrn2外切核酸酶和终止因子的接入（Morales等人，2016年；Skourti-Stathaki等人，2011年）。目前还不清楚这种转录终止机制的普遍性如何，因为这种系统只在少数转录位点上得到证实。有趣的是，G富含的终止元素上的R环也诱导反义转录，这反过来导致双链RNA的生成和沉默机器的招募，包括DICER、AGO1和AGO2，如通过ChIP所示（Skourti-Stathaki等人，2014年）。在裂殖酵母中，Dicer有助于在先前被鉴定为复制应激热点的终止位点上释放RNAPII。Dicer的缺失似乎会在这些位点引起R环的积累（Castel等人，2014年），但这需要确认。这些结果与在哺乳动物中进行的全基因组分析相吻合，这些分析显示R环的位置和转录终止位点之间存在相关性（Sanz等人，2016年）。因此，R环可能在某些情况下有助于转录终止。

虽然仅限于特定情况，但具有生理角色的R环的存在，引发了一个问题：它们是自发发生的，还是由特定蛋白质因子的作用介导的受调控的过程？事实上，有几种蛋白质表现出RNA结合活性和与DNA双链互补链杂交的能力。体外，哺乳动物的帽装酶绑定到磷酸化的RNAPII，能够在转录试验中促进R环的形成（Kaneko等人，2007年），病毒编码的ssDNA结合蛋白ICP8促进RNA分子入侵同源受体质粒，生成一个R环（Boehmer，2004年）。CRISPR-Cas9提供了生物体内DNA-RNA杂交调控过程的最好例子（Jinek等人，2012年）。

具有功能角色的DNA-RNA杂交体需要调控的需求，也由存在特定蛋白质因子的事实所示，这些因子有利于DNA-RNA杂交体的积累。因此，DDX1解旋酶解开在IgH S区转录物中发现的G4结构，使RNA与DNA杂交，从而提供了AID作用所需的ssDNA底物，然后进行类切换重组（Ribeiro de Almeida等人，2018年）。同样，DHX9 RNA解旋酶在剪接体缺陷条件下促进R环积累（Chakraborty等人，2018年）。鉴于DHX9的敲低抑制了在着丝粒区域的生理R环的积累，DHX9被认为可能通过解开RNA二级结构，即使在正常条件下也参与这些结构的形成（Chakraborty等人，2018年）。其他可以促进R环积累的蛋白质活性可能依赖于通过ssDNA结合蛋白对非模板ssDNA的隔离。因此，最近的观察表明，线粒体ssDNA结合蛋白稳定了R环的形成（Posse等人，2019年）。

总的来说，现有的实验证据表明，DNA-RNA杂交体可以提供一种特定的基因表达调控机制，可能由特定的蛋白质机器推动，而在大多数情况下，这些机器尚需被解码。这与细胞为限制它们的形成和有害后果而发展出来的自发和非计划的R环形成形成对比。防止非计划R环的有害影响的机制有三种：（i）预防，（ii）解决，和（iii）与DNA复制/修复耦合的移除。下面三节将讨论这些活动。

（未完待续）

文章来源：doi.org/10.1016/j.cell.2019.08.055