三代测序100问（23）：基于长读长测序的人类基因组重测序分析流程02

在上一期节目中，我们共同搭建了长读长人类基因组重测序分析的地基，梳理了从碱基识别（Basecalling）、质量控制（QC）到参考基因组比对（Alignment）的前半部分流程。如果说前三步是数据的“清洗与定位”，那么今天我们要讲解的后半部分——变异检测、单倍型分型以及变异注释，则是数据的“挖掘与解读”，是真正产出生物学价值的核心环节。 让我们继续沿着 Genome Research 最新综述的脉络，深入探索长读长测序如何重新定义基因组分析的标准范式。

第四步：变异检测（Variant Calling）——多维度的精准捕获

在整个重测序流程中，变异检测无疑是最关键的一步。不同于二代测序主要聚焦于点突变，长读长测序的变异检测是一个多维度的过程，通常涵盖以下五大类：

1. 单碱基变异与小片段插入缺失（SNV/Indel）：

随着深度学习模型（如DeepVariant, Clair3）的引入，PacBio HiFi数据的SNV检测精度已达到二代测序水平，ONT数据在最新算法加持下也取得了巨大突破。长读长不再只是“读得长”，它同样“读得准”。

1. 结构变异（SV）：长读长的“主战场”

这是长读长测序真正的杀手锏。包括大片段的插入、缺失、倒位、重复和易位。由于长读长序列能够完整跨越结构变异的断点（Breakpoints）和复杂区域，它在检测灵敏度、假阳性控制以及变异边界定位方面，远优于基于短读长推断的方法。

1. 串联重复扩增（TR）：神经遗传病的“金标准”

许多神经退行性疾病（如亨廷顿舞蹈症、脆性X综合征）由短串联重复序列异常扩增引起。长读长能够直接“读通”完整的重复单元区域，不再依赖统计学推断，从而能够准确计算重复次数并检测序列内部的异质性，被视为该领域的检测“金标准”。

1. 拷贝数变异（CNV）：综合信号的判断

长读长对CNV的检测策略正在不断完善，它不单依赖单一指标，而是综合了多种信号进行判断：

• 测序深度（Read Depth）： 区域拷贝数增加会导致覆盖深度显著升高，反之则下降。
• 比对模式（Alignment Patterns）： 某些长读段在断点处无法正常比对（Split reads），提示结构发生改变。
• 片段长度分布： 异常的插入或缺失会导致读段在特定区域的堆积或分布异常。

这使得长读长在检测较大的基因组扩增或缺失时表现出稳健的性能。

1. 碱基修饰（Base Modification）：表观遗传的“免费午餐”

长读长最具变革性的一点在于，它在获取ATCG序列的同时，还能直接输出碱基修饰信号（如5mC甲基化）。这意味着在不改变实验流程的前提下，就可以获得表观遗传学层面的信息，即可实现“基因组测序 + 表观修饰检测”的一站式完成，为疾病研究和功能基因组学提供了额外的表观遗传学维度。

第五步：单倍型分型（Phasing）——区分“父源”与“母源”

由于Read足够长，一条序列往往能同时覆盖多个杂合变异位点，这使得每条序列天然携带了父源或母源的连续遗传信息（Linkage）。 通过分型分析（Phasing），我们可以明确判断两个变异位点是位于同一条染色体（顺式，Cis）还是分别位于两条同源染色体（反式，Trans）。

• 临床意义： 在隐性遗传病诊断中，如果患者的两个致病突变呈“反式”排列（复合杂合），则可能致病；若呈“顺式”排列（即便携带两个突变，但另一条染色体正常），则通常不致病。二代测序往往需要家系验证才能解决的问题，三代测序可以单人单次检测直接给出答案。

第六步：变异注释（Annotation）——从数据到意义

分析的终点是回答“检测到的变异意味着什么？”。变异注释是将生物学意义赋予ACGT变化的过程。

• 常规注释： 评估变异是否位于编码区、是否改变氨基酸序列（错义/无义）、在人群数据库（gnomAD等）中的频率、以及在疾病数据库（ClinVar等）中的记录。
• 功能预测： 预测变异是否影响蛋白结构、剪接位点（Splicing）或调控元件。
• 长读长特有注释： 对于结构变异（SV）和串联重复（TR），我们需要结合专门的策略来评估其潜在致病性，例如该SV是否破坏了拓扑关联域（TAD）边界，或TR扩增是否超过了致病阈值。

总结

至此，我们通过两期节目，系统梳理了基于长读长的人类基因组重测序标准分析流程：从精准的碱基识别出发，经过严格的质控与比对，深入进行多维度的变异检测，利用单倍型分型理清遗传来源，最终通过注释揭示生物学意义。

好了，这期节目就到这里，我们下期见！

额外知识：

检测 CNV 需要依据多个“线索”，没有一种信号能独立判断：

1. 测序深度变化： 如果某区域拷贝变多，深度会升高；变少，深度会下降。
2. 片段长度/比对状态分布： 例如读段在某位置异常堆积或缺失。
3. 比对异常模式： 比如某些长读段无法对准预期位置，提示结构发生了变化。