胰腺癌是最常见的致死性实体恶性肿瘤，迫切需要预测性生物标志物来指导治疗。我们生成了一个胰腺癌患者衍生的器官样(PDO)文库，概括了原发性胰腺癌的突变谱和转录亚型。发现了新的驱动癌基因，转录组分析揭示了独特的簇。PDO对标准化疗药物和研究药物表现出不同的反应。得出了基于器官样的化学敏感性基因表达特征，该特征预测了许多患者在辅助化疗和晚期疾病情况下对化疗的改善反应。最后，使用靶向药物治疗谱为化疗难治性PDOs推荐了替代治疗策略。PDOs的分子和治疗组合图谱可以预测临床反应，并实现前瞻性治疗

02 文章背景

胰腺导管腺癌(PDAC)是一种致命的恶性肿瘤，通常诊断出来已在晚期。15-30%的PDAC患者被诊断为临床局限性疾病，可接受潜在治愈性手术切除。手术切除后，大多数患者会有局部或远处复发，并死于该疾病。新辅助化疗或辅助细胞毒性化疗形式的系统治疗与肿瘤切除术联合使用，但仅增加了适度的生存期益处。大多数患者外科手术不适宜，被诊断为局部晚期或转移性疾病。目前对局部和转移性胰腺癌患者的治疗选择通常基于患者的表现状态和并发症。预测最有效化疗方案的方法应能改善患者护理。
为了确定最有可能受益于化疗的患者，我们产生了预测化疗敏感性的PDO衍生基因标志物。这些化学敏感性标志物可以追溯性地识别出PDAC患者，在辅助治疗或晚期疾病环境中更有可能对几种化疗药物产生反应。这些化疗敏感性标志物可以使PDAC患者更快地进行治疗分层，分为受益于现有化疗干预的患者和应该考虑合理靶向和研究药物的患者。

03 实验流程

研究是从PDAC病人的肿瘤部分取样做3D培养：总共是138个病人，里面取了 159个样品，包括 primary tumors (hT) metastases (hM)

78 个样本是specimens were isolated from surgical resections
60 个样本是fine needle biopsies of primary or metastatic lesions (hF)
20个样本是 metastatic disease following rapid autopsies
1个样本是a video-assisted thoracoscopic surgical (VATS) resection of a lung metastasis

值得一提的是还有 11 human normal (hN) pancreatic ductal organoids were established from heathy normal pancreata

实验过程：

1.WGS

2.RNA-seq

3.药物处理

04 实验结果

1. Assembling a pancreatic cancer patient-derived organoid library

胰腺癌患者来源的有机类库

在138名PDO患者中，我们获得了来自原发性肿瘤（HT）和转移（HM）的159个样品
将 78 个标本与手术切除分离，60 来自初级或转移性病变的活组织检查（HF），20个样本来自尸检后的转移性疾病，1个来自电视辅助胸腔镜手术（VATS）切除肺部转移。

我们成功地扩展了至少5代的PDO培养物。使用这些指标，PDO的生成效率为75%(活检-HF为72%，肿瘤切除-HT为78%)，101名患者(73%的患者)共114次PDO培养
在培养基中添加血清不利于分离和繁殖
胰腺癌PDO呈混合形态，由中空上皮衬里的囊状结构组成，腔内充盈程度不同

2. Patient-derived organoids recapitulate genetic hallmarks of pancreatic cancer and reveal new characteristics

患者衍生的有机化合物概括了胰腺癌的遗传特征，并揭示了新的特征。

我们开发了一个精确的医药控制面板，当有机物培养通过质量控制标准时，它首先关注PDO文库的分子特征。分类为确认肿瘤PDO培养的标准要求存在已知的致病突变。到目前为止，88种PDO培养物已经进行了Sanger或WES，69种(78%)的PDO培养物含有与PDAC一致的遗传改变。

一小部分(14%)的KRAS突变PDO只有一种肿瘤抑制因子失活。66个PDAC PDO培养物中有64个是非整倍体的，而hT83和HF43这两个培养物保持了很大程度的二倍体基因组

在这些培养物中，ht83含有krasg12R和tp53突变，但没有表现出tp53LOH或其他典型的肿瘤抑制基因的失活；而hf43具有错配修复缺陷的特征，包括msh6突变，mlh1完全丢失，插入和缺失频率(每兆碱基)比队列平均值(11.54indels/mb)高8倍以上。

对手术切除的PDAC确认的PDO及其匹配的原发肿瘤(原发肿瘤)的子集进行全基因组测序，两者均使用正常组织(n=13)进行胚系校正

大多数原发性肿瘤标本的纯度不足以显示拷贝数改变（CNA），而在PDO培养物中容易辨别CNA和总染色体重排

除了HT PDO和原发肿瘤配对外，还对8种HF PDO培养进行了胚系校正的WGS。由于从这些活检中获得的组织数量很少，所以整个标本都是针对PDO的生成，因此无法获得来自HF PDO培养的原发肿瘤组织来进行比较。在几种PDO HF培养物中也观察到复杂的基因组重排

3. Transcriptomic profiling and subtyping of pancreatic cancer PDO cultures

胰腺癌PDO培养的转录图谱和亚型分析

对44个PDAC确认的PDO和11个HN有机培养物进行RNA测序。在主成分分析中，HN培养与PDAC PDO分开聚类

这些PDO RNA测序数据被用来鉴定先前从虚拟显微切割后的大块组织中获得的经典和碱基样亚型特征

利用非负矩阵分解(NMF)聚类对PDO转录本进行独立分类，发现PDAC PDO培养物中有两个稳定的簇

GSEA富集了C1簇的转化生长因子β信号和EMT。相反，簇C2通过GSEA表现出对异生代谢、脂肪酸代谢和氧化磷酸化的富集。虽然组成C1/C2标记的基因与定义基本和经典亚型的基因不重叠(1个基因重叠是MYO1A)，但分类结果与83%的基本相似的PDO培养落入C1分类，93%的经典PDO培养落入C2聚类。因此，PDO培养揭示了独特的基因表达程序，将PDAC分为两个不同的类别。

4. PDO pharmacotyping corresponds with individual patient treatment responses

PDO药物分型与患者个体治疗反应相对应

对66例PDAC确诊的PDO进行了治疗概况或“药物分型”，使用了最常用于治疗PDAC患者的5种化疗药物：吉西他滨、NAB-紫杉醇(用于PDO的紫杉醇)、伊立替康(SN-38，用于PDO的活性代谢物)、5-氟尿嘧啶(5-FU)和奥沙利铂。PDO药物分型显示，根据剂量反应曲线和曲线下的相应面积(AUC)评估，PDO对单一化疗药物的反应具有显著的患者间变异性

PDO培养药型在多代传代中是稳定的，只有偶尔观察到微小的变化

对于每种化疗药物，我们将PDO文库分为三个亚组：最不敏感(耐药，最高34%的AUC)，最敏感(敏感，最低33%的AUC)和中等反应(中间33%的AUC)。为了确定这一亚型对个别患者是否有用，我们对9名接受这5种药物治疗的晚期pdac患者进行了回顾性临床随访

产生HF2 PDO的PDAC患者首先接受四种药物的联合治疗，其中包括两种PDO反应中等的药物(奥沙利铂和5-FU)和一种PDO反应耐药的药物(紫杉醇)。

该患者在原发灶和转移灶均表现出早期进展，并改用二线方案，其中包含PDO敏感的两种药物(吉西他滨和SN-38)。

5. Temporal evolution of PDO chemo-sensitivity

PDO化疗敏感性的时间演变

在类似的案例研究中，我们发现纵向PDO产生反映了单个患者的临床过程

6. Spatial intra-patient heterogeneity of chemo-sensitivity

化疗敏感性的患者的空间异质性

rapid autopsy 后，检测了从同一患者的两种肝（HM19A，B）和一个膈肌转移（HM19C）和一个膈肌转移（HM19C）产生的四种不同PDO培养物的治疗敏感性

7. Nomination of alternative treatment strategies for chemo-refractory PDO cultures

化疗耐药PDO培养替代治疗策略

为了确定PDO培养的替代治疗策略，使用一组靶向药物(n=21)对66种PDAC确认的PDO培养进行药物分型

8. PDO pharmacotranscriptomic signature reflects treatment response in pancreatic cancer patients

PDO药物转录信号反映胰腺癌患者的治疗反应

对于每种化疗药物，我们计算了PDO基因表达和每种药物的AUC之间的Spearman相关性，从而定义了不同的转录信号。

为了研究PDO药物分型是否可以应用于晚期胰腺癌患者，我们通过将PDO转录图谱与药物分型结果相关联来生成药物敏感性信号。对于每种化疗药物，我们计算了PDO基因表达和每种药物的AUC之间的Spearman相关性，从而定义了不同的转录信号。

我们改进了这些特征，以包括当AUC降低(Rho值为负值)时表达增加的基因，这表明药物敏感性增加。通过使用单个药物反应签名对PDO培养进行聚类，PDO可以针对每个单独的化疗标志物被分成敏感或非敏感类别。为了确定PDO衍生的药物转录信号是否反映了患者的治疗反应，我们从126名接受胰腺肿瘤切除术后接受辅助治疗(n=95)或不接受治疗(n=31)的患者获得肿瘤细胞富集基因表达数据和相关的临床信息

我们用这一标志物评估了55名接受吉西他滨单一疗法的患者的反应，结果发现，吉西他滨敏感性信号丰富的患者无进展存活率显著提高(PFS，772vs373天，HR=0.54，P=0.04)

在91名接受吉西他滨单一治疗或吉西他滨与5-FU或顺铂联合治疗的患者中，将这种吉西他滨敏感性转录标记应用到91名患者中，也发现患者的PFS明显改善，但OS没有明显改善

在30名未接受治疗的患者中，吉西他滨敏感性标志物没有发现PFS或OS改善的患者

在这组样本中，43%的患者肿瘤(55/126)是基底样亚型的PDAC。接受治疗的患者要么单独接受吉西他滨治疗，要么与其他化疗药物联合治疗。因此，将吉西他滨特异性PDO敏感性标志物应用于该患者队列，并确定50%的患者被富集。

COMPASS试验中的患者患有晚期胰腺癌，并在接受联合化疗之前接受了活检。活检组织的大小足以进行激光捕获显微切割以进行mRNA分离和转录分析。30%(22/73)的肿瘤为基底样型。我们发现44、37、31、29和36名患者(60%、51%、42%、40%和49%)分别对奥沙利铂、5-氟尿嘧啶、SN-38、吉西他滨和紫杉醇表现出PDO衍生的敏感性标志物富集

奥沙利铂标记与接受FOLFIRINOX治疗的患者(n=47)的疗效显著相关。具有奥沙利铂标记的患者比不敏感的患者对FOLFIRINOX的肿瘤反应更好，但是5-FU和SN-38标记没有提供额外的信息

19例晚期PDAC患者在接受吉西他滨和NAB-紫杉醇联合化疗前进行肿瘤活检，8周后再次测定RECIST标准。在这一较小的患者亚群中，7名患者具有吉西他滨敏感性特征，7名患者还表现出紫杉醇敏感性特征

在ICGC-CA和COMPASS研究中，PDO化疗敏感性标记能够方便地识别反应更好的患者，这表明这些标记在前瞻性临床试验中进行评估后可能具有潜在的临床实用价值。

05 延伸

1. PDAC背景知识

胰腺癌生长快而且转移率高，是一种非常致命的恶性疾病。2016年美国癌症协会的数据显示，胰腺癌患者的5年生存率在7-8%之间。

虽然手术可以根治这种疾病，但胰腺癌在确诊时只有10–20%是可切除的，其它患者只能接受化疗。

2018年 2月8日在Nature Communications上发表的GWAS研究纳入了21,536人，发现位于人类染色体1（位置1p36.33）、7（位置7p12）、8（位置8q21.11）、17（位置17q12）和18（位置18q21.32）上的新鉴定的遗传变异可增加胰腺癌风险。这些基因组中每个拷贝的存在都会增加胰腺癌风险15％-25％。

关于胰腺癌发生的缘起假说目前主要集中在两个学说：

一个是最早由肿瘤遗传学传奇人物Alfred G Knudson提出的肿瘤的“二次打击学说”
其后由诸多胰腺癌研究领域的科学家完善并确定提出的“Kras-CDKN2A-P53-SMAD4”成次序改变和逐步积累的描述胰腺肿瘤由PanINs发展至PDAC的学说体系。

自此，古老的基于病理形态的学科体系与新型的基于基因分子生物分型的学科体系变得不再各自孤立：近20年间的系列研究在胰腺癌中比较有代表性地强调了胰腺癌病理形态改变和分子生物学改变的平行相关性。而2017年的一项来自dana farber和哈弗医学院的最新研究更是在356例胰腺癌样本中较为全面和完整地的探索四个关键驱动基因改变与胰腺癌预后的相关性（四大驱动基因中，KRAS和CDKN2A与临床预后紧密相关；与此同时，驱动基因的突变个数越多，预后越差）

TCGA数据分析PDAC分成两个大类：

The Basal-like, Squamous or Quasi-mesenchymal, subtype identifies PDAC patients with poor prognosis and is characterized by basal markers such as cytokeratins.
The Classical or Pancreatic Progenitor subtype is characterized by differentiated ductal markers and identifies patients with a better prognosis.

2. 实体瘤的反应评估标准(RECIST）

恶性肿瘤严重威胁人类的健康，全球的科研工作者致力于寻找更为有效的药物或方案以提高这些致命性疾病的疗效，因此客观评价肿瘤治疗的疗效显得尤为重要，特别是在临床试验中。正是基于以下原因，1979年WHO ( World Health Organization)制定了抗肿瘤治疗客观疗效的评价标准四:①客观肿瘤疗效是试验药物或方案的预期目的,其结果是决定该药物或方案是否值得进步研究的依据；②由于抗肿瘤药物的临床试验的对象常为晚期肿瘤病人，其生存期受到限制，所以常略去生存期，而仅以用药后肿瘤大小的变化来判断抗肿瘤药的疗效；③抗肿瘤疗效也是临床医生病人决定是否继续治疗和研究项目是否继续进行的依据。二十多年来，这个标准被普遍用于实体瘤的疗效评价,但存在如下问题：没有对需要测量的病灶及需要进行评价的病灶作个统一的规定；未明确规定所应测量的最小病灶的大小及所应测量病灶的数量;对判定为PD(恶化)的标准不确定，是评价单个病灶还是全部肿瘤不明确；对已广泛应用的检查结果如CT和MRI并未提及。因此，造成各研究组之间疗效评价存在差异而难以比较，往往导致不正确的结论。针对以上问题,1999年EORTC (Eu-ropean Organization for Research and Treatment ofCancer) NCI (National Cancer Institute of the UnitedStates)和NCIC (National Cancer Institute of Canada)在回顾普遍使用的WHO疗效评价标准的基础上、制定了新的实体瘤疗效评价标准，称为RECIST标准(Response Evalnation Criteria in Solid Tumors)。并在JNCI杂志上发表了该标准的草案，经过必要的修改和补充在2000年颁布了该标准的正式指南。

RECIST标准同WHO标准的最大区别在于，判定抗肿瘤效果时采用的测量肿瘤大小的方法：

RECIST标准以肿瘤的最大长径评价肿瘤的大小

WHO标准以肿瘤的最大长径与其最大垂直径的乘积评估肿瘤的大小

单径测量方法取代双径测量方法有其数学理论依据，James等对肿瘤的直径、双径乘积、肿瘤细胞数之间的关系进行了研究，他们发现当肿瘤为球形病灶时，肿瘤的体积可按以下公式计算：

(其中V为体积.r=半径，D=直径)。

由于直径1cm的球形肿瘤包含1x109的肿瘤细胞、故肿瘤体积可换算成肿瘤细胞数。因此当直径以cm表示时，体积以细胞数表示，对上述等式两侧取对数.可发现肿瘤直径或肿瘤双径乘积与肿瘤的细胞数相关.公式如下:

James 等通过绘制直径，双径乘积、体积的对数图，发现肿瘤的直径与肿瘤细胞数量的变化关系比肿瘤双径乘积与肿瘤细胞数量的变化更密切，在此理论基础上NCI等组织提出以单径测量方法代替既往的双径测量方法（WHO方法），并认为单径方法可能更为精确，而且重复性更好

3. FOLFIRINOX治疗

4. ICGC-CA

ICGC全称是International Cancer Genome Consortium (国际癌症基因组联合体)。其旨在发起和协调大量的研究项目，其共同目标是全面阐明导致全球人类疾病负担的多种癌症中存在的基因组变化。

ICGC的主要目标是在全球范围内具有临床和社会重要性的50种不同癌症类型和/或亚型的肿瘤中生成全面的基因组异常（体细胞突变，基因异常表达，表观遗传修饰）目录数据，尽可能快地向整个研究团体提供数据，并且以最小的限制，加速研究癌症的成因和控制。ICGC促进了成员之间的沟通，并为广大科研人员提供了一个平台，达成治疗和预防这些疾病的最大化目标。

ICGC Data Portal提供了用于可视化，查询和下已发布的数据的数据工具。

1.进入ICGC官网：https://icgc.org/，往下拉，在左下方，可以看到ICGC的数据类型

2.在网站最上方导航栏进入数据界面：Data Portal

3.进入Data Portal之后，选择DCC Data Releases进入数据版本

4.点击current进入数据选择界面

5.进入到数据界面，点击Projects

6.然后就到达选择下载界面，有TCGA、TARGET的数据，如果大家需要分析TCGA或者TARGET的数据库，那么直接进入TCGA和TARGET官网下载和分析就可以了，没有必要在这里选择。选择感兴趣的研究。

补充：

科研

【生信文献200篇】22 胰腺癌的类器官可以辅佐治疗决策

01 文献概述

SUMMARY