00 文献信息

「英文标题」 Immune recognition of somatic mutations leading to complete durable regression in metastatic breast cancer

「中文标题」 免疫识别体细胞突变导致转移性乳腺癌的完全持久退化

「期刊」《Nat Med.》 「影响因子」 36.13

「研究领域」 临床治疗 乳腺癌

「DOI号」10.1038/s41591-018-0040-8

01 总述

作者研究了一位接受肿瘤浸润淋巴细胞(TILs)治疗的具有耐药性的HR阳性转移性乳腺癌患者，对四种蛋白SLC3A2, KIAA0368, CADPS2和CTSB的突变反应。这些突变蛋白特异性TILs结合白介素-2和检查点封锁介导转移性乳腺癌的完全持久消退，目前正在进行>22个月。

❝We present a patient with chemorefractory hormone receptor (HR)-positive metastatic breast cancer who was treated with tumor-infiltrating lymphocytes (TILs) reactive against mutant versions of four proteins SLC3A2, KIAA0368, CADPS2 and CTSB. Adoptive transfer of these mutant-protein-specific TILs in conjunction with interleukin (IL)-2 and checkpoint blockade mediated the complete durable regression of metastatic breast cancer, which is now ongoing for >22 months, and it represents a new immunotherapy approach for the treatment of these patients.

❞

02 背景

使用检查点阻滞或抗肿瘤淋巴细胞过继性转移的免疫疗法(Immunotherapy)在治疗高水平体细胞突变的癌症显示出了有效性。在转移性胆管、结肠癌和宫颈癌患者中，靶向体细胞突变基因编码蛋白的自体淋巴细胞过继转移导致临床疗效不佳。

肿瘤免疫疗法

• 免疫疫苗
• 免疫检查点抑制剂治疗
• 过继性免疫细胞治疗
• 细胞因子治疗

其中以CTLA4、PD1/PDL1抑制剂为代表的「免疫检查点抑制剂」，以其显著的临床疗效而备受瞩目。

而本文的研究属于肿瘤免疫治疗的过继性T细胞疗法（ACT）领域，之前以CART为主，最近出现了另外一种疗法——TIL（Tumor Infiltrating T cell，肿瘤浸润淋巴细胞），表现也十分惊艳，Rosenburg博士及其团队就是这一领域的代表。

03 数据&方法

该研究是通过一个病人进行采样及测序分析的，其具体临床信息(NCT01174121)为：

① 49岁女性；

② ER-positive and HER2-negative；

③ 转移性乳腺癌：metastatic breast cancer；

④化疗疗效低：refractory to multiple lines of chemotherapy

多组学测序

该研究既做了全外显子又做了转录组测序，还有单细胞测序。但仅公开的数据是 PRJNA342632 for exome data and PRJNA243084 for RNA-seq data。

作者只探索了一个病人，但测了：FrTu (118×)，OCT (120×) ，normal blood (116×)。也是常规的肿瘤外显子数据分析流程，其实就是GATK best-practices 流程加上 varscan2，再使用 ‘allele-specific copy-number analysis of tumors’ (ASCAT) 和Sequenza 来分析肿瘤纯度和倍性，然后得到的somatic 变异过滤如下：

• tumor and normal read counts of 6 or greater,
• variant-allele frequency (VAF) ≥ 5%
• tumor-variant reads ≥ 3

其RNA-seq测序也是走的STAR比对加上GATK best-practices 流程来找变异。

最后使用 PyClone 进行克隆进化分析。

相关实验

• Coculture assays:
  • IFN-γ enzyme-linked immunospot (ELISPOT) assay,
  • enzymelinked immunosorbent assay (ELISA)
  • flow cytometry
• 免疫组织化学染色

04 结果

somatic变异

右乳房皮下病变的全外显子组测序(WES)和RNA测序(RNA-seq)显示存在62个（过滤后）非同义体细胞突变。

构建TMG(tandem minigene，串联微型基因)来挑选病人那些可以特异性识别相关突变的TIL细胞。

❝TIL fragments lymphocyte populations derived from culturing small pieces of the patient s tumor in high-dose IL-2 (Supplementary Table 2) were initially screened against all of the mutations by using pulsed peptide pools (PPs 1 6) or transfected mRNAs (tandem minigenes (TMGs) 1 6) expressed in autologous antigen-presenting cells (APCs).

❞

结果发现：

TIL片段F8和F12对PP1有活性，而对相应的TMG1无活性(图1a,b)。TIL F13 对PP6和TMG6均有活性(图1a,b)。

TIL片段的单个肽段筛选显示，F8和F12识别了SLC3A2蛋白(图1c)。

反应性F13 TIL识别突变体ECM29蛋白酶体接头和支架(ECPAS;也被称为KIAA0368)(图1d)。

通过流式细胞术分析发现SLC3A2和KIAA0368突变均会导致4-1BB表达量上调。

作者认为：SLC3A2 and KIAA0368 reactivity was mediated by CD4+ and CD8+ T cells, respectively(图1e,f)。

单细胞测序识别两个基因突变

为了鉴定新抗原反应的T细胞克隆型，根据TRBV区域或4-1BB (CD137, T细胞活化的标记物)的高表达水平对突变肽反应细胞进行分类，然后进行单细胞测序。找到了跟mutant (mut)-SLC3A2 or mutKIAA0368对接的TRBV

图g，通过流式细胞术分析了用编码TCR K的异基因T细胞，该T细胞特异性识别18-mer mutSLC3A2肽，显示4-1BB上调。这些结果代表了所有7个特异性识别mutSLC3A2肽的tcr。图h，通过流式细胞术分析用编码TCR R的序列转导的异基因T细胞，该序列特异性识别25-mer mutKIAA0368 (p.Ser186Phe)肽，显示4-1BB上调。

患者接受了8.2×1010次TILs治疗，如图2a。注入的细胞主要为CD4+(62.5%)，具有效应记忆(CD62L CD45RO+)表型。The infusion product maintained its reactivity to mutSLC3A2 and mutKIAA0368 after rapid expansion of the T cells from the fragments (Fig. 2b), and approximately 21% of the infused CD3+ cells expressed programmed cell death 1 (PD-1).

细胞转移后6周，作者发现靶肿瘤负荷降低了51%；在最近的评估中(细胞转移后22个月)，所有靶和非靶病灶均经放射学处理(图2c)。

为了评估抗PD-1单克隆抗体派姆单抗(pembrolizumab)对患者肿瘤的潜在影响，回顾性分析了PD-1及其配体PD-L1的表达。样本是在细胞移植前获得的两个肿瘤样本。

对注入的细胞群进行TCR-focused deep sequencing ，发现8个突变反应型克隆型(7个SLC3A2-reactive和1个KIAA0368-reactive TCRs)中唯一的TRBV CDR3 编码序列占细胞转移时产生序列的23.1%。（图3a）

其他分析显示有3个TRBV家族(TRBV07, 12.41%;TRBV20, 13.56%;TRBV28(16.54%)在移植后6周血液中显著增加，其中TRBV20和TRBV28至少包含一个显性TCR克隆型(β-chain CDR3, 11.4%;和CDR3，分别为5.4%)的未知反应性(图3b)。

TRBV20+分选的细胞对来自巨细胞病毒(CMV)、EB病毒(EBV)和流感病毒(CEF肽)。通过IFN-γ ELISPOT检测显示FACS分选的TRBV28+细胞对PP6和TMG6表现出特异性识别(图3c)。

TRBV28+细胞特异性识别两种突变蛋白：(图3d)

• calcium-dependent secretion activator 2 (「CADPS2」; p.Arg1266His)
• cathepsin B (「CTSB」; p.Asp159His)

流式细胞术分析显示，转染编码TCR J的构建物的异体外周血T细胞特异性识别25 mer mutCADPS2肽。用编码TCR M(左)或TCR O(右)的构建体转导的异体外周血T细胞，都是TRBV28-01-TRAV12-01，可特异性识别25-mer mutCTSB肽，而对WT CTSB肽的识别很小。

共11个TCR克隆型识别了4136例患者的4种新抗原(SLC3A2、KIAA0368、CADPS2和CTSB)。只有两个TRCs在治疗前的外周血中检测到mutSLC3A2(分别占所有TRBV序列的0.003%和0.002%)。在细胞输注后，作者评估了已知新抗原反应性tcr在外周血中的体内持久性。

第3周第12周的中位累积频率为2.83%的外周曲集，在注射后17个月已知的反应性克隆型占注射后曲集的0.81%(图4a)。

移植后17个月持续存在的8个突变反应性克隆型中的每一个在外周血中的持续模式。Rank表示当所有生产CDR3序列按频率递减排序时，唯一CDR3序列的相对位置。

结论

通过单细胞测序快速鉴定突变蛋白特异性TCR序列可能为一种将新抗原的反应性改造成具有高增殖潜能的自体PBLs的方法，可能比直接使用TILs更有效。

对这个病人来说，发现了 11 TCR clonotypes recognized the four neoantigens (SLC3A2, KIAA0368, CADPS2 and CTSB) 。证明了针对受影响个体的自体肿瘤所呈现的独特体细胞突变的个性化治疗可以介导完全持久的癌症消退。

05 延伸

肿瘤浸润淋巴细胞(TILs)

肿瘤浸润性淋巴细胞（tumor infiltrating lymphocyte, TIL）指的是从肿瘤组织中分离出的浸润淋巴细胞。

1986年，Rosenberg研究组首先报道了TIL细胞。TIL细胞表型具有异质性。一般来说，在TIL中，绝大多数细胞是CD3阳性的。在不同肿瘤来源的TIL细胞中，CD4+ T细胞、CD8+ T细胞的比例有差异，但大多数情况下以CD8+T细胞为主。

不同患者不同肿瘤类型对免疫疗法的反应不可预测，是因为免疫成分的异质性以及肿瘤浸润淋巴细胞（TILs）在单个肿瘤内和患者之间的多样化表型。

并不是所有的肿瘤浸润T细胞都是针对肿瘤抗原的，并且发现检测CD39的表达可以简单的量化或分离Bystander 即“旁观者”T细胞。

技术历史

早在2014年的时候Rosenburg博士的团队就将其一部分研究结果发表在Science期刊（Tran E et al, Science 2014）上，当时他们的做法是：把一名晚期胆管癌女患者的肺转移肿瘤「病灶」拿来做全基外显子测序，找到了26个非同义突变，「并为每一个突变构建了一段短基因，将这些短基因几个一组地串联成短基因串（Tandem Minigene, TMG）」，然后将这些短基因串转入抗原递呈细胞（指树突状细胞DC）并与肿瘤浸润淋巴细胞（TIL）共同培养，以查看患者的TIL中是否存在可以特异性识别肿瘤突变的T细胞。不出所料，这位患者的TIL可以识别肿瘤的一个突变。研究者将这个有识别功能的T细胞体外大量扩增后再回输给患者，患者肝部的转移灶长期稳定状态达1年以上。Rosenburg博士的团队通过这个研究，证明了晚期癌症患者的肿瘤组织中确实是存在可以对抗肿瘤突变的淋巴细胞的、即便是在晚期胆管癌这样凶险又难治的瘤种。

参考自：肿瘤资讯。

「但是从实体瘤中收集浸润性T细胞确实比较有挑战性，而与之相比，抽取患者的外周血则容易得多」，所以2016年Steve Rosenberg小组发表在《自然-医药》杂志上的文章《Prospective identification of neoantigen-specific lymphocytes in the peripheral blood of melanoma patients》即是从晚期恶性黑色素瘤患者的「外周免疫细胞」中可根据PD-1受体表达找到针对肿瘤变异新抗原的活性杀伤T细胞。这样找到的T细胞在体外增殖后和肿瘤浸润淋巴细胞（TIL）一样可以识别患者自身肿瘤。

但是恶性黑色素瘤是一种突变比较多的肿瘤，尽管外周血抗肿瘤细胞比例低，但是仍然能够分离出来；而其他突变较少的肿瘤在外周血中是否同样存在这样的T细胞就存疑了。

ClinicalTrials.gov

本文所设计的在线数据库：「ClinicalTrials.gov」是一个由私人和政府资助的全球临床研究数据库，由美国国家医学图书馆提供的资源，共包含50个州，220个国家，375,253项研究。

这个数据库的界面较为简单，也比较容易上手使用。该数据库的内容更偏向于临床。

网址：https://clinicaltrials.gov/