🤩 scRNA-seq | 吐血整理的单细胞入门教程（从原理到代码实操）（一）

1写在前面

炙手可热的单细胞测序（scRNA-seq）大家肯定都或多或少听过一些，从今天开始陆续分享我的学习笔记，有不对的地方大家多指正~🤒

在开始前我们先思考几个问题，如下：👇

Q1: 什么是scRNA-seq，它与bulk RNA-seq相比如何？ Q2: scRNA-seq有哪些典型应用？ Q3: scRNA-seq如何准备样品？

2什么是scRNA-seq？

2.1 什么是bulk RNA-seq

要搞懂什么是scRNA-seq，我们先了解一下bulk RNA-seq。🥳

RNA-seq用于由细胞混合物组成的样本中，称为bulk RNA-seq，常用于研究control/diseased、wild-type/mutant之间的转录组差异。

然而，使用bulk RNA-seq，我们只能估计每个基因在细胞群中的平均表达水平☹️，没有考虑该样本中单个细胞基因表达的异质性。

举个栗子🌰，早期发育研究或大脑等复杂组织。

2.2 scRNA-seq横空出世

为了解决异质性的问题，2009年首次报道了单细胞水平的RNA-seq，即scRNA-seq，

与bulk RNA-seq不同的是，使用scRNA-seq可以评估每个基因在不同细胞群中的表达水平分布。🤩

成功解决了转录组中细胞特异性变化的问题。可以发现新的或稀有的细胞类型，识别control/diseased组织之间的差异细胞组成或了解发育过程中的细胞分化。

2.3 scRNA-seq图谱

目前有很多的scRNA-seq图谱，全面解析了不同物种中的细胞类型。举几个栗子🌰，如下：

• Human Cell Atlas (H. sapiens)
• Tabula Muris (M. musculus)
• Fly Cell Atlas (D. melanogaster)
• Cell Atlas of Worm (C. elegans)
• Arabidopsis Root Atlas (A. thaliana)

随着技术的进步，scRNA-seq方法学层出不穷，自首次报道后的技术发展，我们可以看到随着技术的进步，scRNA-seq可以检测到更多的细胞。

但需要说明一下，不同的技术各有其优缺点，还是老观点，新技术不一定是最好，选适合你的就行了。🧐

3scRNA-seq的样品制备

3.1 经典protocol

通常来说，经典的scRNA-seq的protocol可以分为以下几个步骤：

• 从组织和细胞培养中制备细胞悬浮。
• 细胞筛选（基于表面marker、转基因技术、染色等）。（可选步骤😊）
• 捕获单个细胞（如wells，oil droplets)。
• 从每个细胞中提取RNA。
• 将RNA反转录为cDNA。
• 扩增cDNA（体外转录或 PCR）。
• 准备测序文库，adapters。
• 测序。
• 处理raw data以获得细胞基因的count矩阵。
• 进行下游分析。

3.2 制备样品困难怎么办？

在难以分离细胞的组织中或在冷冻组织样本中，可能较难实现单细胞的制备，我们可以选择制备单个细胞核样本。

Note! 但需要注意一下，核RNA通常含有较高比例的未加工unprocessed RNA,，会测序到大量含有introns的转录本。😲

具体的解决方案，我们后面再介绍吧。😘

3.3 常用protocol的对比

这里我们比较一下目前常用的protocol，这里不包括Smart-seq3和Smart-seq3xpress，后面我们单独介绍这两种方法。

4细胞捕获

目前应用最广泛的三种方法为microtitre-plate, microfluidic-array 和 microfluidic-droplet。

各有其优缺点，这里只做简单介绍，感兴趣的小伙伴可以去Google一下具体差异。

1️⃣ Microtitre-plate

• 优点是建库之前可以对细胞进行观察，识别并丢弃受损的细胞等。
• 缺点是低通量。

2️⃣ Microfluidic-array

• 优点是通量比Microtitre-plate通量高，省试剂😂。
• 缺点是不适合稀有细胞的处理。
• 这里提醒大家要注意一下arrays的nanowells大小问题。

3️⃣ Microfluidic-droplet

• 优点是高通量，低成本。💰
• 缺点当然也是低成本带来的啦😂，一般coverage都比较低，往往检测深度就不够了，transcripts比较少。

Tips! 如果用FACS分离细胞的话，可以染一下live/dead, 避免一些活力低的细胞影响结果。😘

最后祝大家早日不卷!~