🤩 scRNA-seq | 吐血整理的单细胞入门教程（从原理到代码实操）（二）

1写在前面

上期我们分享了单细胞测序（scRNA-seq）的基本概念，样品的制备以及细胞的捕获。😁

本期我们继续介绍一下转录本定量分析、实验设计、批次效应和混杂因素。🤒

在开始前我们还是先思考几个问题，如下：👇

Q1: 不同protocol有什么区别，优缺点是什么？ Q2: 在进行scRNA-seq的实验设计时，要考虑哪些问题？ Q3: 与bulk RNA-seq的数据相比，scRNA-seq数据有什么不同？

2定量方法

目前我们常见的转录本定量方法有两种，full-length和tag。🧐

2.1 full-length

full-length实现整个转录本的count，而tag的只capture5'或3'端。🤨

scRNA-seq的full-length文库构建与bulk RNA-seq相似，如SMART-seq2。

从理论上讲，full-length应该可以提供一个均匀的转录本coverage，但有时在coverage上还是有一定的偏差。

full-length一大优势就是可以检测到不同剪接体(splice variants)。😯

Full-length RNA library preparation for Illumina sequencing.

2.2 tag

如果使用tag的方法进行scRNA-seq，则只对转录本的一端（3'或5'）进行测序。

目前大多数scRNA-seq都是基于tag的，如10x Chromium，

• 优点：可以与UMI（unique molecular identifiers）结合，提高定量的准确性。
• 缺点: 由于只限于转录本的一端，无法区分isoforms。

Example of 3’ bias in the gene body coverage, after aligning the sequencing reads to the transcriptome.

Note! 这个图展示了不同细胞中average coverage的情况，有明显的3' bias。

而且3个细胞群明显离群，可能是RNA降解导致的。

2.3 为什么使用UMI

由于在PCR的过程中，扩增是指数级的，可能会导致扩增不均，从而高估基因的表达量。🫠

为了解决这个问题，cell barcodes会标记上一段随机核苷酸序列（UMI），而这个UMI是唯一的。

在读取count时，将UMI纳入，从而更准确的计算转录本的丰度。🤫

Protocol overview of 3’ libraries using the 10X Chromium protocol.

2.4 选3' 还是5' tag

这个可能要根据大家具体的实验目的来进行选择，常用的就是3’的方法。🧐

但5'也有其优势，如可以获得有关转录起始位点（TSS）的信息，从而探索不同细胞之间是否存在不同的TSS。😘

Single Cell 3' v3.1(Dual Index) Gene Expression Library

Single Cell 5' v2 Gene Expression Library

3实验设计

3.1 那么多方法怎么选？

首先我们要明确的就是选择不同方法还是要基于你的科学问题，你的研究目的。😐

低通量的方法与高通量的方法相比具有更高的灵敏度，如10x Chromium。

另一方面，低通量方法很难capture到样本中一些比较稀有的细胞类型，导致细胞群的特征不完整。😤

3.2 scRNA-seq数据的不同之处

测序完成后，每个library代表一个细胞，而不是一群细胞。🤩

所以，每个细胞都是独一无二的，在单细胞水平上没有办法进行 "生物学重复"。😕

我们一般需要进行相似性聚类，然后在相似细胞群之间进行比较。

4批次效应

批次效应（batch effects）是一定要考虑到的问题，即使用不同的技术对相同的样本进行scRNA-seq，也会有批次效应，可以通过normalise来减少批次效应。

The same cell population was sequenced with three different single-cell protocols (colours).

5混杂因素

整个scRNA-seq的过程中，应避免实验因素（如治疗、表型或疾病等）、准备样品时间、测序时间等对结果的影响。

• 举个栗子🌰
• 假设我们准备对10个病人的control和diseased组织进行scRNA-seq，如果每天只能处理10个样本，最好是每天做5个control和5个diseased的样本，而不是一天准备所有control的样本，另一天准备所有diseased的样本。

另一个需要考虑到的就是样本的可重复性。

• 举个栗子🌰
• 当从一个器官收集组织时，最好从器官的不同部位采集多个样本。
• 由于基因表达可能受昼夜节律（circadian changes）的影响，我们最好也在同一个时间点进行取样。

Illustration of a confounded (top panels) and balanced (bottom panels) designs.

最后祝大家早日不卷!~