R|clusterProfiler-富集分析
简单总结clusterProfiler包进行GO、KEGG的富集分析方法，结果输出及内置的图形展示。
一 bioconductor包安装
#PS：安装是否顺利，看缘分了
#source("https://bioconductor.org/biocLite.R")
#biocLite("DOSE")
#biocLite("topGO")
#biocLite("clusterProfiler")
#biocLite("pathview")##加载需要的R包
library(DOSE)
library(org.Hs.eg.db)
library(topGO)
library(clusterProfiler)
library(pathview)二、数据载入及转化
需要将输入的基因格式转为clusterProfiler可分析的格式，通过功能函数bitr实现各种ID之间的转化。通过keytypes函数可查看所有支持及可转化类型
keytypes(org.Hs.eg.db)
1.向量方式读入#适合少量基因
x <- c("AASDH","ABCB11","ADAM12","ADAMTS16","ADAMTS18")
test = bitr(x, #数据集
fromType="SYMBOL", #输入为SYMBOL格式
toType="ENTREZID", # 转为ENTERZID格式
OrgDb="org.Hs.eg.db") #人类 数据库
head(test,2) SYMBOL ENTREZID
1 AASDH 132949
2 ABCB11 86472.基因list文件读入
data <- read.table("gene",header=FALSE) #单列基因名文件
data$V1 <- as.character(data$V1) #需要character格式，然后进行ID转化
#将SYMBOL格式转为ENSEMBL和ENTERZID格式
test1 = bitr(data$V1, fromType="SYMBOL", toType=c("ENSEMBL", "ENTREZID"), OrgDb="org.Hs.eg.db")
head(test1,2) SYMBOL ENSEMBL ENTREZID
1 AASDH ENSG00000157426 132949
2 ABCB11 ENSG00000073734 86473. 内置示例数据
data(geneList, package="DOSE") #富集分析的背景基因集
gene <- names(geneList)[abs(geneList) > 2]
gene.df <- bitr(gene, fromType = "ENTREZID", toType = c("ENSEMBL", "SYMBOL"), OrgDb = org.Hs.eg.db)
head(gene.df,2) ENTREZID ENSEMBL SYMBOL
1 4312 ENSG00000196611 MMP1
2 8318 ENSG00000093009 CDC45三、 GO分析
3.1 groupGO 富集分析
ggo <- groupGO(gene = test1$ENTREZID, OrgDb = org.Hs.eg.db, ont = "CC",level = 3,readable = TRUE)3.2 enrichGO 富集分析
ego_ALL <- enrichGO(gene = test1$ENTREZID,
universe = names(geneList), #背景基因集
OrgDb = org.Hs.eg.db, #没有organism="human"，改为OrgDb=org.Hs.eg.db
#keytype = 'ENSEMBL',
ont = "ALL", #也可以是 CC BP MF中的一种
pAdjustMethod = "BH", #矫正方式 holm”, “hochberg”, “hommel”, “bonferroni”, “BH”, “BY”, “fdr”, “none”中的一种
pvalueCutoff = 1, #P值会过滤掉很多，可以全部输出
qvalueCutoff = 1,
readable = TRUE) #Gene ID 转成gene Symbol ，易读
head(ego_ALL,2)
ONTOLOGY ID Description
GO:0002887 BP GO:0002887 negative regulation of myeloid leukocyte mediated immunity
GO:0033004 BP GO:0033004 negative regulation of mast cell activation
GeneRatio BgRatio pvalue p.adjust qvalue geneID Count
GO:0002887 2/121 10/11461 0.004706555 0.7796682 0.7796682 CD300A/CD84 2
GO:0033004 2/121 10/11461 0.004706555 0.7796682 0.7796682 CD300A/CD84 2
其中：ONTOLOGY：CC BP MF
GO ID: Gene Ontology数据库中唯一的标号信息
Description ：Gene Ontology功能的描述信息
GeneRatio：差异基因中与该Term相关的基因数与整个差异基因总数的比值
BgRation：所有（ bg）基因中与该Term相关的基因数与所有（ bg）基因的比值
pvalue: 富集分析统计学显著水平，一般情况下， P-value < 0.05 该功能为富集项
p.adjust 矫正后的P-Value
qvalue：对p值进行统计学检验的q值
geneID：与该Term相关的基因
Count：与该Term相关的基因数3.2.1 setReadable函数进行转化
ego_MF <- enrichGO(gene = test1$ENTREZID, universe = names(geneList),OrgDb = org.Hs.eg.db,ont = "MF", pAdjustMethod = "BH",pvalueCutoff = 1,qvalueCutoff = 1,readable = FALSE)
ego_MF1 <- setReadable(ego_MF, OrgDb = org.Hs.eg.db)
3.3 GSEA分析 （暂略）3.4 输出结果及图像
3.4.1 输出结果
write.csv(summary(ego_ALL),"ALL-enrich.csv",row.names =FALSE)3.4.2 绘制图形
##可视化--点图
dotplot(ego_MF,title="EnrichmentGO_MF_dot")#点图，按富集的数从大到小的
##可视化--条形图
barplot(ego_MF, showCategory=20,title="EnrichmentGO_MF")#条状图，按p从小到大排，绘制前20个Term##可视化--
plotGOgraph(ego_MF)3.5 过滤
3.5.1 利用内置cutoff设置阈值，by设定指标
#可能会有问题，还不太清楚
ego_MF.fil <- simplify(ego_MF, cutoff=0.05, by="pvalue", select_fun=min)3.5.2 存储结果然后过滤
ego_ALL.sig <- ego_ALL[ego_ALL$pvalue <= 0.01]过滤后为数据框，不能用自带的参数直接绘制，可以使用ggplot2进行绘制。（暂略）
四、KEGG分析
4.1 候选基因进行通路分析
kk <- enrichKEGG(gene = test1$ENTREZID,
organism = 'hsa', #KEGG可以用organism = 'hsa'
pvalueCutoff = 1)
head(kk,2)
ID Description GeneRatio BgRatio
hsa04750 hsa04750 Inflammatory mediator regulation of TRP channels 5/53 97/7387
hsa04020 hsa04020 Calcium signaling pathway 6/53 182/7387
pvalue p.adjust qvalue geneID Count
hsa04750 0.0006135305 0.08589427 0.0807277 40/3556/3708/5608/79054 5
hsa04020 0.0018078040 0.12654628 0.1189345 493/1129/2066/3707/3708/4842 64.2 富集结果及图形展示
4.2.1 结果输出文件
write.csv(summary(kk),"KEGG-enrich.csv",row.names =FALSE)4.2.1 KEGG 气泡图
dotplot(kk,title="Enrichment KEGG_dot")4.2.2 查看特定通路图hsa04750 <- pathview(gene.data = geneList,
pathway.id = "hsa04750", #上述结果中的hsa04750通路
species = "hsa",
limit = list(gene=max(abs(geneList)), cpd=1))
五、注释文件、注释库
如果clusterProfiler包没有所需要物种的内置数据库，可以通过自定义注释文件或者自建注释库的方法进行富集分析。
5.1 自定义注释文件
5.1.1 待富集的基因list
data(geneList, package="DOSE")
deg <- names(geneList)[abs(geneList)>2]
5.1.2 读入注释文件：
## downloaded from http://www.disgenet.org/ds/DisGeNET/results/all_gene_disease_associations.tar.gz
gda <- read.delim("all_gene_disease_associations.tsv")
head(gda,1)geneId geneSymbol diseaseId diseaseName score NofPmids NofSnps source
1 1 A1BG C0001418 Adenocarcinoma 0.002732912 1 0 LHGDN自定义的两个注释文件（重要）
disease2gene=gda[, c("diseaseId", "geneId")]
disease2name=gda[, c("diseaseId", "diseaseName")]5.1.3 enricher函数进行富集分析
x = enricher(deg, TERM2GENE=disease2gene, TERM2NAME=disease2name)
head(summary(x),1)
ID Description GeneRatio BgRatio pvalue p.adjust
C3642345 C3642345 Luminal A Breast Carcinoma 11/198 110/17074 6.057328e-08 0.0001488891
qvalue geneID Count
C3642345 0.0001287342 9833/55355/3620/891/9122/2167/3169/5304/2625/9/5241 115.2 数据库
5.2.1 查看当前支持的物种
Bioconductor - BiocViews
5.2.2 通过AnnotationHub自建OrgDb注释库并富集
library(AnnotationHub)
hub <- AnnotationHub() #较慢
query(hub, "Cricetulus")
Cgriseus <- hub[["AH48061"]]
sample_gene <- sample(keys(Cgriseus), 100)
str(sample_gene)
sample_test <- enrichGO(sample_gene, OrgDb=Cgriseus, pvalueCutoff=1, qvalueCutoff=1)
head(summary(sample_test))六、参考资料
Statistical analysis and visualization of functional profiles for genes and gene clusters
以上，clusterProfiler包进行GO、KEGG的富集分析方法，结果输出及内置的图形展示。待补充富集结果ggplot2绘制，GSEA等相关分析。
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