lncRNA实战项目-第五步-差异表达的mRNA和lncRNA

响应生信技能树的号召：lncRNA数据分析传送门, 一起来一个lncRNA数据分析实战！

很明显，得到了表达矩阵之后，根据上面的样本信息，可以按照年龄，性别，取样部位来进行分组找差异。

可以参考：https://github.com/jmzeng1314/my-R/tree/master/DEG_scripts

上一步骤得到了表达矩阵，两个样本分别是F_1yr.OC和M_1yr.OC, 所以接下来的差异分析就是比较1岁猕猴脑OC区域女性和男性的差别，差异分析的分析方法很多，主要根据前面标准化的方法，有基于counts的差异分析，也有基于标准化后的FPKM，TPM等的差异分析。

常见的R包有（摘自https://github.com/jmzeng1314/my-R/tree/master/DEG_scripts）：

edgeR (Robinson et al., 2010)

DESeq / qDESeq2 (Anders and Huber, 2010, 2014)

DEXSeq (Anders et al., 2012)

limmaVoom

Cuffdiff / Cuffdiff2 (Trapnell et al., 2013)

PoissonSeq

baySeq

作业里给的参考是一步法差异分析，是对常见的R包做了下封装，包括了对转录组的raw counts数据分析DEseq2包和edgeR包，及对于芯片等normalization好的表达矩阵数据的limma和t.test等。用的时候只要设置好表达矩阵和分组矩阵，然后选择特定的方法，一步就可以进行差异分析。

但是这里的样本是无生物学重复的，无重复的数据做差异分析是一件很麻烦的事，可靠性都不能保证。。。但是目前由于测序的价格，还有样本自身的珍贵稀缺性，部分实验设计仍然是没有生物学重复的。对于无重复样本的差异分析有几种方法可以选择，如edgeR，DEGseq和GFOLD等。下面分别尝试edgeR，DEGseq及GFOLD：

edgeR做无重复样本的差异分析

edgeR针对无重复样本给出了四条建议，第一条建议是仅分析MDS plot和fold changes，不做显著性分析；第二条建议是设置合适的离散度值，然后做个exactTest 或glmFit；第三条看不懂；第四条建议是基于大量的稳定的参照转录本。

edgeR

DEGseq对无重复样本差异分析

也有推荐DEGSeq 中MARS方法的（MARS: MA-plot-based method with Random Sampling model）。

MA.plot

GFOLD对无重复样本进行差异分析

该软件称尤其适合做无重复样本的差异分析，他对foldchange 的计算考虑到posterior distribution，即克服了pvalue评估显著性的缺点，同时也克服了 fold change 在评估低counts 数的gene时的缺点。

下载软件：

安装GFOLD时，需要先安装gsl,然后再编译安装gfold。

该软件的功能包括5部分：

1）Count reads and rank genes；

2）Count reads；

3）Identify differentially expressed genes without replicates;

4)Identify differentially expressed genes with replicates;

5)Identify differentially expressed genes with replicates only in one condition.

下面是无重复样本计算差异的例子：

对于前面得到的counts列表（hisat_matrix.out）每个样本单独分开，并命名为samplename.read_cnt(一定要加后缀.read_cnt).

这里查看下F.OC.read_cnt是否有头文件，若有最好注释掉，否则后面差异结果有错位。然后用gfold diff 一步就可以求出差异基因。输出文件包含4列，第一列GeneID, 第二列是gfold值，gfold值的正负对应着基因的上调和下调，gfold=0认为是无差异的，E-FDR对无重复样本总是1，第四列是log2fold change。

上调基因：4324，下调基因：4240，差异变化阈值设置gfold为1时，上调的基因有83个，下调有97个。

差异基因初步统计

用edgeR共筛选到1322个差异显著基因（筛选条件：PValue1）; 用DEGseq共筛选到743个差异显著基因（筛选条件：abs(log2(Fold_change) normalized ) >1 & p-value < 0.05 & q-value(Storey et al. 2003) 1 && gfold

参考资料：

一步法差异分析：https://github.com/jmzeng1314/my-R/tree/master/DEG_scripts

从零开始学转录组（7）：差异基因表达分析

从零开始学转录组（8）：富集分析

RNA-seq项目设计：生物学重复和单个样本测序量对结果的影响

clusterProfiler参考文档

差异基因分析

文献：Efficient experimental design and analysis strategies for the detection of differential expression using RNA-Sequencing

编辑：jimmy

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