增强花青素稳定性——与有机酸的共色沉着

合作单位：Hebei Agricultural University

参考文献：Lv X, Li L, Wang W, et al. Effects of organic acids on color intensification, thermodynamics, and copigmentation interactions with anthocyanins. , Hebei Agricultural University, 2022, 396: 133691. DOI: 10.1016/j.foodchem.2022.133691 (IF=8.8)

背景：

花青素在红色、紫色、蓝色和其他五颜六色的花朵、水果、叶子和蔬菜中占有重要地位。由于其迷人的颜色和安全性，花青素作为替代合成色素的天然着色剂越来越受到食品工业的关注。即使在低浓度下，花青素也是强大的天然抗氧化剂。然而，由于花青素缺乏电子，它们在不同的pH值和温度条件下暴露于氧气、金属离子、二氧化硫和光下很容易降解。由于这种降解，花青素的颜色会褪色，并且在食品加工过程中失去生物活性。

多种技术已被用于稳定花青素，包括共色素沉着、包封、合成代谢和酰化。共色素沉着是一种增强花青素稳定性的有效方法，通过将含有共色素的富电子π系统与电子不足的黄烷基阳离子结合形成络合物。这种技术还可以增强或创造新的色调，这对着色剂是有益的。通常，共色素沉着会导致可见光范围内的吸光度增加（超染色位移）和最大吸光度向更长波长的偏移（深色色位移）。高色色位移和深色色位移可以用于评估共色化效应。在这方面，分子间和分子内相互作用都起着重要作用。分子内相互作用主要由于花青素的自缔合而存在。分子间相互作用是指花青素和非花青素色素（包括酚酸、蛋白质、金属离子和多糖）之间氢键、疏水力、范德华力和离子相互作用的形成。花青素的黄酮阳离子几乎是平面的，它们更有可能与具有相似结构的共色素相互作用。在各种色素中，黄酮、羟基肉桂酸和羟基苯甲酸等酚类化合物由于其π共轭体系和酚环的延伸(如通过电子给体甲氧基)而对花青素的稳定性有积极的影响。

花青素的结构也直接影响分子间的共色素相互作用。酰基化和非酰基化花青素具有不同的化学反应活性。由于缺乏对酰基化花青素的标准，对酰基对共色素化的影响缺乏明确的认识。因此，为了评价酰基化花青素的共色素化行为和颜色特征，需要利用热力学测量和量子力学计算进行系统的机理研究。

Kyoho葡萄皮(KSA)花青素具有很高的营养价值，主要包括酰基化花青素；然而，没有研究调查过它们的稳定性。在该研究中，选择KSA来研究酰化花青素的共色素化相互作用。Cy-G是分布最广的非酰化花青素，用于比较它们相互作用的差异。四种富含羟基的酚酸[单宁酸(Tan)、阿魏酸(Fer)、咖啡酸(Caf)和丁香酸(Syr)]和一种二元酸[酒石酸(Tar)]作为色素。研究了色素摩尔比对花色苷吸收性能的影响。随后，进行了热力学测量来评估结合相互作用。此外，利用量子力学计算研究了参与共色素化的可能机制。

方案设计：

为了研究四种花色苷与KSA的结合模式。通过与魔德科技技术团队沟通，拟通过序列比对、同源模建、分子对接和分子动力学的方法探索构建色素苷和KSA蛋白的结构，并通过量子力学计算研究了参与共色素化的可能机制。

主要结果：

通过HPLC-MS分析鉴定花青素

KSA的总花青素含量为121.73±3.65 mg/g，包含广泛的单体花青素。采用梯度反相高效液相色谱-质谱联用技术对花青素进行了快速鉴定。HPLC-MS分析中检测到的每种花青素的分子离子、片段离子和保留时间见表S1。HPLC-MS检测到的花青素片段仅对应5种花青素:花青素(m/z 287)、芍药苷(m/z 301)、飞鸽苷(m/z 303)、矮花苷(m/z 317)和马蹄莲素(m/z 331)。总的来说，KSA含有5个3- o -单葡萄糖苷衍生物，1个3,5- o -二葡萄糖苷衍生物，1个香豆素化二葡萄糖苷衍生物和4个香豆素化3- o -单葡萄糖苷衍生物。通过保留时间的不同，对马柳苷-3- o -香豆醇-葡萄糖苷和芍药苷-3- o -香豆醇-葡萄糖苷的顺式和反式结构进行了区分。顺式异构体比反式异构体的洗脱时间更早。花青素以MCG为主(17.46%)。

温度对色素沉着相互作用的影响

紧接着，研究了共色素沉着反应与温度之间的关系。Δλ的变化麦克斯和ΔAmax配合物的温度值如图1所示。Δλmax所有配合物的值均随着温度的升高而降低。在较高温度下，共色素沉着反应向反应物转移，从而破坏了花青素和辅色素之间的弱相互作用。ΔAmax表现出与Δλ相同的趋势，在研究的温度范围内的值，表明温度具有低色素效应。应该注意的是，KSA/Tar的ΔAmax值为负值，说明Tar不能有效保护花青素，导致温度升高导致花青素严重降解。因此，推测花青素通过堆叠自缔合比通过π-π相互作用与Tar共色素沉着具有更高的耐热性。添加Tar可能会中断花青素的自缔合，导致显着的花青素降解。除Tar外，所有辅助色素都阻止了花青素的热降解，其中棕褐色在高温下对花青素稳定性的增强最大。观察到的稳定性变化表明，形成的复合物的结合能或亲和力取决于环境条件，例如温度以及色素和花青素的结构。

图1 Δλmax(a)-(b)和ΔAmax(c)-(d)在30–90°C的温度范围内与共色素的KSA和Cy-G配合物。（P ≤ 0.05）。

量子力学分析

量子力学计算是详细研究化合物构象的有效工具。选择了Cy-G和葡萄皮中含量高的两种花青素（MCG和Dp-G）进行理论研究。MCG、Cy-G 和 Dp-G 与 Fer 配合物的优化构象如图 2 所示。值得注意的是，Cy-G/Fer和Dp-G/Fer配合物表现出相似的构象。在 Dp-G/Fer 配合物中，Fer 位于 C 上方6-C3-C6 Dp-G的骨架，从而形成完全平行的排列。然而，在Cy-G/Fer配合物中，由于形成斜平行排列，Cy-G的结构发生了一定程度的扭曲。这种构象的差异可能有助于Cy-G和Fer之间的关联。与Cy-G / Fer和Dp-G / Fer复合物不同，MCG / Fer复合物表现出拱形构象，可能是由于 MCG中的酰基引起的空间位阻理论相互作用能（ΔE理论）的MCG/Fer复合物高于其他两种复合物，表明MCG/Fer复合物最稳定。

图2 在 MCG/Fer(a)、Cy-G/Fer(b)和Dp-G/Fer(c)配合物中形成的氢键。分子间氢键用绿色虚线表示。

为了进一步分析分子间共色素沉着的驱动力，采用分子中的原子（AIM）理论来识别分子间相互作用的类型。这些计算是在M062X/6-31G(d,p)的理论水平上进行的。首先列出了临界点的类型和数量，其中vdW和HB分别表示直接范德华相互作用和氢键，配合物中形成的氢键如图2所示。这些数据表明，范德华和氢键相互作用是共色素沉着进程的主要驱动力，证实了热力学实验的结果。环临界点 （RCP） 显示三个配合物中存在环结构。由于Cy-G/Fer具有最少的RCP，因此其结构可能并不紧密。然而，Cy-G/Fer的相互作用能高于Dp-G/Fer。众所周知，RCP的数量并不总是正确预测相互作用强度。每个复合物中的笼状临界点（CCP）显示几个环之间形成一个笼子，表明复合物具有三维构象。

采用独立梯度模型（IGM）研究了3种花青素/Fer配合物中的弱相互作用。这种分析可以揭示相互作用的区域和强度。在图 3 中，使用比色标度对等值面进行着色，其中红色表示强排斥相互作用，绿色表示弱范德华力，蓝色表示强吸引力相互作用（氢键和静电相互作用）。所有配合物均表现出绿色片状扩展区域，主要对应于π-π相互作用。尽管Dp-G/Fer中的总氢键能较低，但更高的范德华力可能导致更高的ΔE理论，表明稳定性低于其他两种复合物。此外，在花青素的糖基和母体结构之间观察到范德华相互作用，表明糖基团可以增加花青素的稳定性，这与Brauch的实验结果一致。

图3 优化后MCG（a）、Cy-G（b）、Dp-G（c）和Fer之间的弱相互作用（ρ：电子密度；λ：ρ矩阵的特征值）。

结论：

发现与各种有机酸(Tan, Fer, Caf, Syr和Tar)的共色素化可以增强KSA和Cy-G的颜色强度。Cy-G/Tan、Cy-G/ Fer和Cy-G/Tar的最佳吸光度摩尔比为1:100，而其他配合物的显色效果在1:150的摩尔比下达到最大。合成色素的化学结构决定了合成色素的化学结构。与Tar共着色对花青素的吸收性能影响不明显，因为Tar中没有酚环。相比之下，平面色素分子与花青素发色团的相互作用更有效。热力学数据表明，KSA/Fer和Cy-G/Fer配合物的负焓值最大，具有较高的热稳定性。与Cy-G相比，由于花青素糖基酰化引起的位阻，KSA与Fer、Caf和Syr的亲和力较弱(K值较小)。此外，量子力学计算表明，各种花青素与Fer的相互作用能依次为MCG > Cy-G > Dp-G。此外，这些计算证实了非共价相互作用(范德华作用和氢键相互作用)是共色素化的主要驱动力。羟基的存在在络合物的稳定性方面也被证明是不利的。这些发现为研究色素合成效应的起源提供了重要的见解。