无标记药物筛选靶蛋白：DARTS实验服务

一

DARTS 实验原理

DARTS（drug affinity responsive target stability）全称为药物亲和反应的靶点稳定性分析。与游离的蛋白质相比，当小分子配体与靶蛋白结合后，由于氢键等相互作用，蛋白小分子复合物通常会具有更高的稳定性。

用蛋白酶处理样品时，与小分子结合的蛋白拥有较高的水解抗性，结合了小分子的靶蛋白水解程度较低（与未结合小分子的蛋白相比），从而可以通过 SDS-PAGE 比较实验组和对照组的差异，然后通过蛋白质组学鉴定差异条带，筛选鉴定小分子潜在的靶点蛋白。

也可以利用 western-blot 对实验组和对照组中目的蛋白的水解程度进行比较，从而验证蛋白与小分子之间的相互作用。

二

DARTS 实验基本流程

1. 细胞裂解，提取总蛋白（注：使用温和的裂解液，保持蛋白活性）

2. 向总蛋白中添加药物小分子孵育，同时对照加入等体积的实验组中溶解小分子的溶剂。

3. 向上述实验组和对照组中分别加入等量蛋白酶孵育。

4. 进行 SDS-PAGE/LC-MS 筛选靶蛋白或者 western-blot 验证小分子和靶蛋白之间的相互作用

DARTS 基本实验流程

三

案例分享

01

DARTS 技术筛选人参三醇作用靶标 UFL1[1]

人参（Panax ginseng，C.A. Mayer）在中国被用作药用物质已有两千多年的历史，已被证明对与神经、心血管、泌尿、免疫和消化系统相关的各种疾病具有治疗作用。人参皂甙是人参中负责其药理作用的主要活性成分，人参三醇（Panaxatriol）是这些人参皂甙中最丰富的成分，具有显著的药理作用。

本研究通过 DARTS 实验，结合质谱鉴定，鉴定到 UFL1 为人参三醇的潜在靶标（图1A）。实验时，先将人参三醇/对照（如DMSO）和总蛋白进行孵育，之后加入嗜热菌蛋白酶继续孵育，孵育完成后加入 PMSF 终止蛋白酶水解蛋白质，最后进行 SDS-PAGE，对差异条带进行质谱鉴定。本实验还通过 DARTS-WB、CETSA（细胞热迁移）和分子对接等实验验证人参三醇和 UFL1 之间的相互作用（图1B-1G）。

图1 DART/LC-MS 实验鉴定人参三醇靶点以及 DARTS-WB、CETSA 和分子对接验证人参三醇和 UFL1 蛋白相互作用

DARTS assay is to screen proteins that can bind to small molecule drugs, which using the principle that small molecule drug can reduce the sensitivity to proteases of target proteins by binding with the target proteins. According to the reported protocol[2], 50-100 μg protein of C28/I2 cells was incubated with panaxatriol (200 µM) or DMSO for 1 h at room temperature. Then, the protein was divided evenly into 4 parts. Each part was digested by different concentration of thermolysin (Sigma, Cat. T7902) at room temperature for 10 min. Afterwards, stop the proteolysis by phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) on ice for 5 min. Lastly, proteins were electrophoretically separated by SDS-PAGE gel. Coomassie brilliant blue or western blotting was used to evaluate the targeting protein levels.

02

DARTS 技术验证延胡索酸与 DAPK1 蛋白的相互作用[2]

三羧酸循环（TCA cycle）是糖类、脂类、氨基酸三大营养物质氧化分解的共同途径，也是糖、脂肪、氨基酸代谢联系的枢纽，为机体提供能量和生物合成的前体分子。苹果酸酶（哺乳动物细胞内存在 ME1，ME2 和 ME3 三种异构体，其中 ME1 和 ME2 是主要形式）将 TCA 循环的中间产物苹果酸转化为丙酮酸并伴随 NAD(P)H 产生，是三羧酸循环的重要补充反应，使细胞在能量、还原当量和生物合成前体需求之间保持一定的平衡，因此，苹果酸酶代谢是细胞内代谢途径的重要交汇途径。

本研究首先通过代谢组和代谢流分析发现 ME2 缺失细胞中 TCA 中间代谢产物 fumarate（延胡索酸）形成堆积，并且只有延胡索酸可以抑制 CD8+T 细胞的抗肿瘤作用。于是本研究首先通过计算机预测延胡索酸可能的靶蛋白，其中筛选到了 DAPK1，接着通过 DARTS 实验验证了二者的相互作用（图2A），具体方法为将延胡索酸/对照（如DMSO）和总蛋白进行孵育，之后加入嗜热菌蛋白酶继续孵育，孵育完成后水浴加热终止蛋白酶水解蛋白质，最后进行 WB，进行差异化分析。本研究也通过 CETSA（细胞热迁移）（图2B、2D）和 SPR（表面等离子共振技术）（图2I、2J）验证了二者的相互作用。

图2 DARTS、CETSA 和 SPR 等实验验证延胡索酸和 DAPK1 的相互作用

Drug affinity reactive target stability

DARTS was performed as previously described.58 Briefly, cells were lysed in M-PER (Thermo Fisher Scientific, 78501) with protease inhibitor cocktail and phosphatase inhibitor cocktail. The lysates were added 10X TNC buffer (50 mM Tris-HCL pH 8.0, 50 mM NaCl and 10 mM CaCl2) and the protein concentration was determined by BCA assay. Cell lysates were incubated with gradients of fumarate (or other metabolites) or DMSO (solvent) for 1 hour at room temperature and digested with pronase (1:3000 dilution for DAPK1) (Roche, 10165921001) for 30 min at room temperature. The digestion was stopped by boiled. Western blotting was used to determine whether DAPK1 is a direct target of fumarate. b-Actin served as a negative control and ATP as a

positive control.

03

参考文献

1. Kuang B, Geng N, Yi M, et al. Panaxatriol exerts anti-senescence effects and alleviates osteoarthritis and cartilage repair fibrosis by targeting UFL1. J Adv Res. Published online October 21, 2024. doi:10.1016/j.jare.2024.10.016

2. Zhang Z, Yang Y, Chen Y, Su J, Du W. Malic enzyme 2 maintains metabolic state and anti-tumor immunity of CD8+ T cells. Mol Cell. 2024;84(17):3354-3370.e7. doi:10.1016/j.molcel.2024.07.021

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