通过CRISPR/Cas9敲除方法重新评估长链非编码RNA维持小鼠胚胎干细胞多能性的功能

长链非编码RNA（lncRNA）是一类长度不小于200个核苷酸、以RNA形式发挥生物学功能的调控分子[1,2]。然而，lncRNA对胚胎干细胞的影响尚需探讨。既往研究中Guttman等采用基因沉默（shRNA）敲低方法发现26个lncRNA对小鼠胚胎干细胞多能性维持有重要功能，其敲低对转录调控的影响与关键转录因子（TFs）相当[3,4]。lncRNA分子在小鼠胚胎干细胞多能性维持的功能和机制有待进一步确认和研究。

近日，Science China Life Sciences在线发表北京大学未来技术学院分子医学研究所汪阳明/曹慧青团队与南方医科大学皮肤病医院周家健课题组的研究性论文。该工作通过CRISPR/Cas9敲除方法重新评估长链非编码RNA对小鼠胚胎干细胞多能性维持的功能，发现lncRNA对小鼠胚胎干细胞的多能性维持和增殖无显著影响，同时发现与linc1343共转录的Snora73a/b是多能性退出的重要因子。

为了深入探究lncRNA在小鼠胚胎干细胞多能性维持的作用，研究团队采用更为精确的CRISPR/Cas9基因编辑技术重新评估lncRNA在维持小鼠胚胎干细胞多能性的作用。研究团队逐一或组合敲除8个先前被认为对多能性维持至关重要的lncRNA，却意外发现它们对小鼠胚胎干细胞的多能性维持和增殖并无显著影响。随后，单细胞转录组分析也表明这些lncRNA的敲除对多能性基因表达和细胞身份的影响微乎其微。

图1 逐一或组合敲除lncRNA对小鼠胚胎干细胞的多能性维持无显著影响

这一研究结果挑战了之前基于基因沉默筛选实验所得出的结论，提示基因沉默技术在lncRNA功能研究中可能存在局限性。研究团队进一步发现，使用既往研究用于敲低实验的shRNA在相应的lncRNA敲除胚胎干细胞进行敲低实验，观察到多能性基因的表达下调，表明这些shRNA可能产生了脱靶效应，从而误导了之前的研究结果。

图2 与linc1343共转录的Snora73a/b是小鼠胚胎干细胞多能性退出的重要因子

随后，研究团队发现在敲除linc1343后，在分化条件下小鼠胚胎干细胞无法形成拟胚体（EB），多能性基因维持高表达，多能性退出失败。有趣的是，linc1343 RNA本身对小鼠胚胎干细胞分化形成拟胚体无显著影响，但与其共转录的Snora73a/b是小鼠胚胎干细胞多能性退出的重要因子。Snora73a/b在胚胎发育过程中的分子调控机制有待进一步研究。

北京大学未来技术学院分子医学研究所李真博士为该工作的第一作者，南方医科大学皮肤病医院周家健副研究员和北京大学的曹慧青研究员为共同通讯作者。

【参考文献】

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