【文献解读】CRISPR-Cas12a表现出金属依赖的特异性转换

Cas12a是V-A型CRISPR-Cas免疫系统的效应蛋白，其特异性由于潜在的脱靶效应一直是体外和基因组编辑实验中广泛研究的主题。先前的一些报道指出，Cas12a的特异性有可能在生理条件下发生改变。特别是，细胞中游离镁离子的浓度通常会低于体外研究中镁离子使用的浓度。对此，研究人员们期望做出进一步研究以了解这种情况下的Cas12a特异性的差异。最近，美国爱荷华州立大学的研究人员在Nuleic Acids Research 期刊上发表名为CRISPR-Cas12a exhibits metal-dependent specificity switching的论文，该研究揭示了Cas12a表现出金属依赖的特异性转换的结果。

Cas12a的特异性是由crRNA和DNA靶标之间的互补性、DNA靶标旁边的原间隔短回文序列邻近基序（protospacer adjacent motif，PAM）两个主要因素决定。尽管Cas12a的特异性已经被广泛研究，但许多体外研究是在高镁离子浓度下进行的，这可能与细胞内实际的游离Mg2+浓度不一致。为了解决这个疑惑，研究人员通过在一系列Mg2+浓度下对Cas12a同源物的特异性进行分析。研究结果显示，Cas12a会根据金属离子浓度改变其特异性，在低Mg2+浓度下，Cas12a对种子区域的错配容忍度更高，而对PAM远端错配的容忍度则降低。

一、Mg2+浓度影响脱靶和Cas12a的反式切割

先前的研究指出噬菌体通过在PAM和种子区域产生突变来逃避CRISPR介导的免疫反应。然而，研究人员却观察到PAM远端区域的多个错配也能使噬菌体优先从Cas12a中逃逸。通过头对头竞争试验，他们发现了不同类型的噬菌体突变体根据crRNA的匹配程度会呈现出不同的种群分布模式。具体来说，使用完全匹配的crRNA时，种子突变体占优势；而使用远端不匹配的crRNA时，远端突变体开始占优势。此外，研究人员还发现在低MgCl2浓度下（1 mM），种子突变体的切割速度比远端突变体快很多，这与在高MgCl2浓度（10 mM）下的情况相反。

为了进一步分析了Cas12a在不同Mg2+浓度下的特异性，研究人员通过体外质粒文库进行了切割实验。实验中使用了Cas12a-crRNA-蛋白复合物来切割含有突变靶序列的质粒文库，并在不同时间点收集样本，通过琼脂糖凝胶电泳分离并分析切割结果。实验结果显示，不同Mg2+浓度下，Cas12a对种子区域突变的容忍度不同，低Mg2+浓度下容忍度更高，而对PAM远端区域突变的容忍度则降低。

此外，Cas12a被目标序列激活的非特异性DNA切割活性在高Mg2+浓度下更为显著，但在低Mg2+浓度下减弱。这些试验结果表明，Cas12a的特异性和非特异性切割活性都受到Mg2+浓度的显著影响。

图1 利用质粒库切割分析Mg2+依赖的Cas12a特异性

二、PAM-近端和远端突变体受到Mg2+浓度的不同影响

为了了解Mg2+浓度如何影响Cas12a对不同类型的突变体上的识别和切割，研究人员通过火山图和热图等分析工具做了进一步的研究。通过火山图的分析，研究人员比较了在1 mM和10 mM MgCl2条件下，Cas12a切割未切割（uncleaved）或缺口（nicked）的序列。火山图显示，PAM或种子区域的第一个突变在高MgCl2浓度下更可能未被切割，而中间或PAM远端区域的第一个或第二个突变在低MgCl2浓度下更可能未被切割或形成缺口。热图分析则进一步表明在不同Mg2+浓度下，各种突变序列在未切割和缺口分数中的丰度。

此外，研究人员还探讨了Cas12a缺口切割（nicking）的机制，发现在高Mg2+浓度下，特定位置的突变组合导致缺口切割，而在低Mg2+浓度下，中间或PAM远端区域的至少一个突变导致缺口切割。对Cas12a酶的金属离子依赖性进行实验，其结果表明Cas12a的第二链切割步骤在低Mg2+浓度下受到显著影响，尤其是对于AsCas12a，这表明Cas12a的切割活性具有金属离子依赖性。这些研究结果揭示了Mg2+浓度的变化对Cas12a的特异性有显著影响，在低Mg2+浓度下，Cas12a对PAM近端的突变更加宽容，而对PAM远端的突变则宽容度降低。

图2 种子和 PAM 远端区域的特异性在低 Mg2+浓度时均发生变化

三、可视化金属依赖的特异性开关

为了更直观展示Mg2+对Cas12a特异性的影响，研究人员进一步通过实验方法来观察和量化Cas12a在不同金属离子浓度下特异性的变化，并以图表形式展示。他们设置了两种时间点（1分钟和30分钟）来观察Cas12a在不同Mg2+浓度下的切割效率，并通过凝胶电泳分离未切割（负超螺旋）、单链切割（nicked）和完全切割（linear）的DNA。通过计算每个突变序列在不同Mg2+浓度下未切割或单链切割的分数，作者能够估算出DNA完全切割的比例。利用这些数据，研究人员创建了火山图（volcano plots）和热图（heatmaps），这些图表可视化了Mg2+浓度变化对Cas12a切割特异性的影响，揭示了在低Mg2+浓度下，特定突变类型的序列在未切割或单链切割的分数中的变化。

图3 三种Cas12a同源物的金属依赖性特异性转换

四、Mg2+依赖的特异性转换的不同机制

为了探讨Mg2+如何根据不同的突变位置以不同的方式影响Cas12a的特异性，研究人员作者进一步研究了FnCas12a并通过两种不同的方式启动切割反应来分析切割机制，分别是在存在Mg2+的情况下将RNP与DNA混合和在没有Mg2+的情况下先混合RNP和DNA，然后通过添加Mg2+来启动切割。研究结果显示，当切割反应通过添加Mg2+来启动时，完全匹配和种子突变目标的第一链切割在7秒内完成，而PAM远端突变目标在10 mM Mg2+下也显示出快速的第一链切割，但在1 mM Mg2+下则显示出显著降低的切割速率。

此外，研究人员还测定不同条件下切割反应的速率常数，以评估切割步骤的速率限制，其结果表明对于种子突变目标，DNA结合是速率限制步骤，而在低Mg2+浓度下，PAM远端突变目标的切割缺陷可能是在DNA结合后但在每条链切割前的步骤中变慢，这可能是由于必需的构象变化被抑制。

图4 种子和PAM-远端突变体的特异性转换机制各不相同

五、噬菌体逃逸结果揭示了Cas12a同源物特异性的后果

研究人员发现不同Cas12a同源物（如AsCas12a、FnCas12a和LbCas12a）在低Mg2+浓度下的特异性存在差异，但是这种特性异性在面对噬菌体挑战时如何影响噬菌体逃逸还未清楚。为此，研究人员通过在大肠杆菌中表达不同的Cas12a同源物和crRNA，然后感染λ噬菌体的实验。从AsCas12a和FnCas12a处理的培养物中他们发现了噬菌体逃逸突变体，其中AsCas12a处理的噬菌体群体显示出最高的突变多样性，而Fn和LbCas12a处理的噬菌体群体则主要在PAM和种子区域的最有害位置出现突变。此外，对噬菌体群体突变位置进行分析，其结果表明AsCas12a处理的噬菌体群体在PAM和种子区域出现了广泛的突变，而Fn和LbCas12a处理的噬菌体群体则主要在种子区域的特定位置出现突变。

图5 Cas12a同源物具有不同的逃逸结果

六、金属依赖的特异性可以改变噬菌体逃逸的结果

在获得Cas12a酶的特异性受其同源物类型的影响的结果后，研究人员进一步探讨金属离子浓度如何影响这种特异性和噬菌体逃逸的结果。研究人员在补充了不同Mg2+浓度的培养基中重复了噬菌体竞争实验，发现在10 mM Mg2+条件下，PAM远端突变噬菌体在几乎所有培养物中占据了优势，而在150 mM Mg2+条件下，PAM远端突变噬菌体的优势地位显著降低。这些结果表明，细胞内Mg2+浓度的变化可以显著影响噬菌体逃逸的结果，低Mg2+浓度下Cas12a对种子突变的容忍度更高，而对PAM远端突变的容忍度降低。

图6 Cas12a Mg2+依赖步骤且根据突变位点产生不同的影响的模型

综上所述，研究人员通过系列试验研究了CRISPR-Cas12a酶在不同金属Mg2+离子浓度下的特异性变化，并探讨了这些变化对噬菌体逃逸和基因组编辑的影响。研究结果表明Cas12a根据金属离子浓度改变其特异性，降低Mg2+浓度降低了种子错配引起的裂解缺陷，而增加了PAM远端错配引起的缺陷。不同Cas12a同源物在不同镁离子浓度下的特异性存在显著差异，它们处理的噬菌体群体中出现的突变类型和多样性存在显著差异，这种差异改变了噬菌体逃逸的结果。该研究对于理解和优化CRISPR-Cas系统在基因组编辑中的应用具有重要意义。