【百欧泰生物】兔单克隆抗体制备：为生物医学发展注入强劲动力

背景

在现代生物医学研究与生物技术产业的蓬勃发展进程中，抗体技术始终占据着举足轻重的地位。兔单克隆抗体制备技术作为抗体工程领域的一项重大创新成果，正逐渐成为科研人员和生物技术企业关注的焦点。它以独特的优势在基础研究、临床诊断、疾病治疗以及生物制药等多个方面展现出了巨大的应用潜力，为生命科学领域的探索与突破提供了强有力的工具。

制备流程

杂交瘤技术

1. 免疫兔子：选择健康的兔子，一般选择2-3kg的新西兰白兔品种。将目标抗原与佐剂混合乳化后，对兔子进行皮下注射或肌肉注射等方式免疫。初次免疫时，抗原用量一般为100-500 ug /只，佐剂可选用弗氏完全佐剂；加强免疫时，抗原用量可适当减少至50-200 ug/只，佐剂可选用弗氏不完全佐剂，免疫间隔一般为2-4周，通常需要进行3-5次免疫。

2. 收集B细胞：最后一次免疫后1-2周，通过手术摘取兔子的脾脏，置于含有适量PBS或细胞培养液的无菌平皿中，用注射器活塞轻轻研磨脾脏，使淋巴细胞释放出来，制成单细胞悬液，通过离心等方法收集B细胞。

3. 制备骨髓瘤细胞：常用的骨髓瘤细胞系有SP2/0和NS-1等，需在含有10%-20%胎牛血清的 RPMI-1640等培养基中培养，细胞密度维持在1×105-5×105个/mL，培养温度为37℃，5%CO2孵育箱中培养，取处于对数生长期的骨髓瘤细胞用于融合。

4. 细胞融合：将收集的B细胞与骨髓瘤细胞按一定比例混合，一般B细胞与骨髓瘤细胞的数量比为1:1-10:1，加入聚乙二醇（PEG）等融合剂诱导细胞融合。PEG的浓度一般为40%-50%，融合时间为1-2分钟，然后缓慢加入无血清培养基终止融合反应，离心弃上清，将融合后的细胞重悬于含有次黄嘌呤-氨基蝶呤-胸腺嘧啶核苷（HAT）的选择性培养基中，接种到96孔细胞培养板中，每孔细胞数约为1×105-5×105个。

5. 筛选杂交瘤细胞：在 HAT 选择性培养基中培养1-2周后，未融合的B细胞和骨髓瘤细胞会死亡，只有融合成功的杂交瘤细胞能够生长。通过酶联免疫吸附试验（ELISA）等方法筛选出能够分泌特异性抗体的杂交瘤细胞阳性孔。

6. 单克隆化：将筛选出的阳性孔中的杂交瘤细胞进行有限稀释法单克隆化操作，以获得单个细胞的克隆。有限稀释法：将细胞稀释至每毫升含10-100个细胞，然后接种到96孔板中，每孔0.1-0.2mL，培养1-2周后观察单克隆细胞的生长情况，挑选单个细胞形成的阳性克隆进行扩大培养。

7. 抗体生产与纯化：将筛选得到的单克隆杂交瘤细胞扩大培养，可采用体外培养或体内培养的方式。体外培养时，将细胞接种到细胞培养瓶或生物反应器中，在适宜的培养基和培养条件下培养，收集培养上清液，通过亲和层析、离子交换层析等方法纯化抗体；体内培养时，将细胞接种到小鼠等动物体内，待动物产生腹水后，收集腹水，离心去除杂质，再通过纯化方法获得高纯度的抗体。

噬菌体展示技术

1. 免疫兔子：同上述杂交瘤技术中的免疫兔子方法。

2. B细胞收集与RNA提取：免疫后一段时间，从兔子的脾脏等淋巴组织中收集B细胞，采用 Trizol试剂等方法提取细胞中的总RNA，一般每 1×107个细胞可提取1-2mg总RNA。

3. cDNA 合成与抗体基因文库构建：将提取的RNA反转录成cDNA，然后以cDNA为模板，通过PCR 扩增抗体的重链和轻链可变区基因，并将其组装成Fab或ScFv等抗体片段基因文库。PCR扩增条件与单B细胞技术中的类似，文库的库容一般要求达到106-108左右。

4. 噬菌体展示文库构建：将抗体基因文库与噬菌体载体连接，转化到大肠杆菌等宿主菌中，构建噬菌体展示文库。

5. 噬菌体筛选：将噬菌体展示文库与目标抗原进行多轮的亲和筛选，进行3-5轮筛选。每轮筛选时，抗原可包被在酶标板或磁珠等固相载体上，加入噬菌体展示文库孵育，然后洗去未结合的噬菌体，收集结合的噬菌体进行下一轮筛选，每轮筛选的富集倍数一般要求达到102-103倍左右。

6. 单克隆抗体获得与验证：经过筛选后，获得与抗原特异性结合的噬菌体抗体克隆，将其转化为可表达完整抗体的载体，在细胞中表达并纯化得到兔单克隆抗体，最后通过ELISA、Western blot等方法对抗体的特异性、亲和力等进行验证。

技术优势

1. 卓越的特异性：兔子的免疫系统具有独特的抗原识别机制，能够产生针对抗原细微表位差异的高度特异性抗体。这使得兔单克隆抗体在复杂的生物样本中，能够精准地识别并结合目标抗原，有效避免与其他无关分子的非特异性结合，从而显著提高了检测和分析结果的准确性与可靠性。

2. 高灵敏度：兔单克隆抗体的高灵敏度也是其备受青睐的重要原因之一。由于其对目标抗原具有较强的亲和力，能够在极低的抗原浓度下实现有效的结合和检测。兔单克隆抗体凭借高灵敏度，可以在纳克甚至皮克级别的抗原浓度下产生明显的检测信号，大大提高了疾病早期诊断的可能性。

3. 丰富的多样性：兔子的免疫球蛋白基因库具有高度的多样性，这为兔单克隆抗体的多样性提供了遗传基础。在免疫过程中，兔子能够针对同一抗原产生多种不同特异性和亲和力的抗体克隆。这种丰富的多样性使得兔单克隆抗体能够识别更多种类的抗原表位，拓宽了其在生物医学研究和临床应用中的应用范围。

挑战与展望

兔单克隆抗体制备虽在生物医学等领域极具潜力，但面临着诸多严峻挑战。免疫环节中，抗原的特性与免疫方案的适配性难题突出，常出现抗体产量难以提升、兔子免疫反应过激或抗体特异性不达标的状况；细胞融合时，融合效率受多种因素制约而难以提高，杂交瘤细胞筛选过程也因检测手段局限而准确性欠佳；抗体生产阶段，体外培养稳定性差，体内培养面临伦理争议与质量把控困境，纯化环节又极易造成抗体活性受损与杂质残留。然而，随着基因编辑技术对免疫原优化、人工智能辅助流程设计、纳米技术助力细胞融合以及新型材料推动纯化工艺革新等多方面技术的不断发展与融合应用，兔单克隆抗体制备有望突破现有瓶颈，在科研探索与疾病防治等诸多方面发挥更为卓越且关键的作用，开启更为广阔的应用前景新篇章。

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参考文献

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