Nat Commun| 兰州兽医研究所团队阐明完整口蹄疫病毒抗原高效保护作用的结构基础

2024年10月10日，兰州兽医研究所郭慧琛团队在Nature Communications发表题为“Foot-and-mouth disease virus antigenic landscape andreduced immunogenicity elucidated in atomic detail”的研究论文。利用冷冻电镜结合大动物免疫实验、病毒中和性噬斑减少实验、液相阻断ELISA试验等揭示了口蹄疫病毒(FMDV)从完整146S解离到12S后免疫效力显著降低的具体机制。该研究揭示了原子分辨率下病毒抗原性变化的特征，解决了FMD研究中长期悬而未决的问题，扩展了对FMDV抗原表位分布和抗体反应的全面理解，是FMDV结构和抗原性研究方面极为重要的突破。将为基于结构的FMD新型多价广谱疫苗的设计提供有价值的指导。

FMD是一种对偶蹄动物具有高度传染性的疾病，其病原为FMDV，包含七种血清型(O、A、C、Asia 1、SAT 1–3)，每种血清型都有多个不断进化的亚型且血清型之间没有交叉保护。成熟的病毒粒子（146S）由一个二十面体衣壳包裹正义RNA基因组构成。病毒衣壳由60个原体组装形成，每个原体包含一个病毒衣壳蛋白VP1、VP2和VP3的单拷贝，以及一个内部的VP4蛋白。与其他小RNA病毒不同，完整的FMDV衣壳很容易在暴露于微热(56°C)或酸性pH值(pH<6.5)时，降解为缺乏VP4的12S五聚体颗粒和不可溶的VP4聚集物。

传统的FMD疫苗以灭活的FMDV为抗原。完整146S的疫苗效力比12S高45至400倍；T细胞反应也依赖于完整的146S并协助诱导中和抗体。这种免疫原性的差异与146S和12S间均具有多个表位的保守性相矛盾。尽管FMDV与宿主免疫系统的相互作用已被广泛研究，但12S在诱导保护性抗体方面效率较低的分子基础一直无法解释。为了研究146S和12S抗原性和免疫原性的差异，该研究首先解析了12S（3.2 Å）及其与靶向病毒粒子内部的单域抗体M3F免疫复合物（3.2 Å）的高分辨率结构。这是首次报道的小RNA病毒五聚体的高分辨率结构，也是首次通过结构解析观察到的抗体靶向小RNA病毒衣壳内部的研究。结果显示，解离后的五聚体表现出显著增加的曲率，顶部（结构蛋白VP1）更向外突出，边缘（结构蛋白VP2和VP3）更向内凹陷，可能是由于原本146S球面结构裂解导致亚单位12S缺乏几何约束。在裂解产生的12S中观察到，VP1和VP2 N端明显的大规模无序，并伴随VP4的丢失。在此基础上，进一步解析了146S与两种不同的146S特异性单域抗体（M678F和M688F）的复合物的高分辨率结构，确定M678F和M688F分别结合在靠近3次轴和5次轴顶点的位置，阻碍了VP1中RGD序列与整合素的相互作用。两个单域抗体采用不同的、与146S结合的特异性机制，M678F通过在3次轴处跨越两个相邻的五聚体来实现与146S的结合特异性。而M688F通过在5次轴顶点处跨越两个相邻的原体5S来实现与146S的结合特异性，该构象表位中因146S的解离导致曲率增加，改变了这些原体在5倍顶点处的距离。两种抗体通过稳定146S颗粒结构、产生RGD与整合素之间的空间位阻，实现对病毒中和效果，而且，两种抗体的协同中和效力比自身单独中和作用强50倍左右。

该研究还通过测量病毒表面表位之间的距离，并使用该研究解析的结构和已发表的FMDV 13个抗体复合物3D结构的聚类分析，重新绘制了146S的抗原位点图谱。新绘制的结构位点包括通过逃逸突变分析鉴定的已知抗原表位，并提示存在潜在的新抗原位点，可供后续研究。一些先前确定的5个抗原位点与该研究中指定的四类抗原位点相关。位点1主要是线性的且对胰蛋白酶敏感，包含VP1的GH环和C端，相当于该研究中的II类位点。除位点5外，位点2-5均为构象位点且对胰蛋白酶具有抗性。该研究不支持将位点1和5分开分类，这两个位点都涉及 VP1的GH环。但是，位点 2、3和4分别对应于研究中的III、I和IV类位点。基于结构的位点分类还允许将非中和抗原位点映射到V类位点，而这是利用逃逸突变实验不能测定的。研究中基于结构的分类还可以分析针对血清中不同类别的单个表位的抗体反应，并显示使用146S和12S免疫诱导不同的抗体谱系。

在该研究中，用等剂量的12S和146S免疫两组猪后，12S组和146S组之间的总FMDV特异性抗体反应水平相似，表明12S效力降低不太可能归因于与146S之间颗粒大小的差异。通过比较146S和12S在猪体内的免疫原性，例如引起中和抗体效力差异和基于结构分类的五类抗体水平的差异，并结合结构抗原位点图谱的分析，发现146S的解离引发多种表位的结构改变和破坏，从而导致12S与146S诱导的抗体谱系显著不同，并显著削弱了12S的疫苗中和效力。由此确定了在以往的研究中，针对FMDV单个抗原表位和肽疫苗在靶动物中表现出不太理想的保护效果的原因。研究最后提示，由于146S独有的中和表位促进了FMDV特异的体液免疫，因此针对这些独特中和表位的鸡尾酒设计，可以在FMDV暴发期间用于紧急免疫疫苗的研发。

中国农业科学院兰州兽医研究所孙世琪研究员、郭慧琛研究员和中国科学院生物物理所王祥喜研究员为论文的通讯作者，中国农业科学院兰州兽医研究所博士生李昊洲、董虎博士和中国科学院生物物理所博士生刘攀为论文第一作者。