Western Blot(蛋白免疫印迹)是分子生物学中检测特定蛋白质的关键技术,而转膜作为其中的核心步骤,直接影响实验结果的准确性。本文将详细介绍转膜的原理、操作步骤及常见问题,帮助新手快速掌握技巧。
一、转膜的作用与原理
转膜是将凝胶电泳分离后的蛋白质从凝胶转移到固相载体(如PVDF膜或硝酸纤维素膜)的过程。通过电场驱动,蛋白质从凝胶迁移至膜上,便于后续抗体孵育和显色检测。
二、转膜方法分类
湿转法(最常用)
适用于大多数蛋白质,尤其是高分子量蛋白(>100 kDa)。
转膜时间长(60-90分钟),需低温环境(冰浴或冷室)。
半干转法
适用于低分子量蛋白(<50 kDa),速度快(15-30分钟)。
对缓冲液和电流要求严格,易发热需控制温度。
三、湿转法操作步骤(以PVDF膜为例)
准备转膜装置
将转膜夹、海绵垫、滤纸、膜浸泡于转膜缓冲液(含甲醇)中10分钟。
注意:PVDF膜需用甲醇预激活30秒,NC膜无需此步骤。
组装转膜“三明治”
按顺序叠放:阴极板海绵垫滤纸凝胶PVDF膜滤纸海绵垫阳极板。
关键技巧:用玻璃棒轻轻滚动排除气泡,避免转膜不均。
设置转膜参数
恒流模式:200-300 mA(根据膜面积调整),时间1-2小时。
高分子量蛋白:可延长转膜时间或降低电流防止过热。
转膜后处理
取出膜,用丽春红染色(可选)确认转膜效果,随后用TBST洗去染料。
四、常见问题与解决方案
转膜后无信号
可能原因:电流/时间不足、膜未激活、方向装反。
对策:检查转膜装置方向,确保PVDF膜充分激活。
背景高或非特异性条带
可能原因:膜未封闭完全、抗体浓度过高。
对策:延长封闭时间(推荐5%脱脂奶粉封闭1小时),优化抗体稀释比例。
高分子量蛋白转膜困难
对策:改用0.45 μm厚PVDF膜,延长转膜时间至2小时以上。
五、抗体选择:实验成功的关键
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