首页
学习
活动
专区
圈层
工具
发布
精选内容/技术社群/优惠产品,尽在小程序
立即前往

JoVE Protocols | 手把手教你如何通过iPSC构建中脑类器官

2025年2月,来自挪威卑尔根大学研究者们在期刊Journal of Visualized Experiments(IF:1.2)发表了一篇题为“Generation of 3D Midbrain Organoids from Human-Induced Pluripotent Stem Cells”的研究文章。

本研究描述了一种从人类诱导性多能干细胞(iPSC)生成特定中脑类器官(MO)的分化方案。该系统可以有效地引导iPSC向中脑分化,并生成具有中脑特征的类器官。因此,该方案为中脑发育过程、与中脑相关的神经退行性疾病的病理研究提供了重要的工具。

文章介绍

题目:Generation of 3D Midbrain Organoids from Human-Induced Pluripotent Stem Cells

期刊:Journal of Visualized Experiments

影响因子:1.2

发表时间:2025年2月

#1

摘要

Abstract

从hPSC中生成MO的发展代表了在理解大脑发育、精确疾病建模和推进治疗研究方面的重要进展。本方案描述了一种利用iPSC生成特定MO的方法。关键技术包括通过双SMAD抑制来下调SMAD信号传导、添加成纤维细胞生长因子8b(FGF-8b),以及使用激动剂普尔莫法明激活Sonic Hedgehog通路,引导iPSC向中脑分化。

通过该方法生成的类器官直径可达2 mm,并包含多种神经上皮细胞类型,反映了中脑固有的细胞多样性。值得关注的是该方法能够有效地将iPSC分化为中脑的典型特征——多巴胺能神经元。这为深入研究中脑的发育过程以及与帕金森病等相关疾病的病理机制提供了宝贵的模型,成为神经科学研究中不可或缺的工具。

#2

研究思路

Methods

MO的构建:神经诱导阶段、MO模式化阶段和MO终末阶段

鉴定MO的中脑特征

#3

实验设计

Design

实验方案示意图

图1:从iPSC分化出MO的示意图。阶段I:神经诱导第0-5天:将iPSC培养在添加了SB431542、NAC和AMP激活的蛋白激酶抑制剂Compound C的限定化学成分培养基(CDM)中,促进神经球的形成。阶段II:MO模式化(第5-19天):将神经球包埋在 Matrigel小滴中,并在含有FGF-8b和模式化培养基(PM)的CDM中于培养箱内进一步培养,导致MO的分化。阶段III:MO终末分化(第19天至≥3个月):分化出的MO在含有脑源性神经营养因子(BDNF)和胶质细胞系来源的神经营养因子(GDNF)的CDM中于培养皿中进一步成熟,完成最终的MO分化。

本研究开发了一种从人源iPSC生成三维MO的方法。分化过程首先通过引导iPSC向神经外胚层谱系分化,形成神经上皮或神经玫瑰花结构的集落。这是通过双SMAD信号通路抑制实现的,其中SB2431542是关键化合物。

接下来的阶段包括在悬浮培养中培养三维神经球。通过使用轨道摇床来增强营养物质和氧气的供应,这对于类器官的发育至关重要。相比于传统的二维培养体系,这种三维模型更好地模拟了人脑的复杂性与结构,并在空间上更接近自然的中脑组织

本方法生成的类器官展现出多样的细胞类型和显著的神经元成熟特性,特别是成功诱导出多巴胺能神经元,为帕金森病等神经退行性疾病的研究提供了理想的模型。与之前的研究相比,本方法在中脑细胞类型生成的特异性与效率上表现更优。

通过显微镜细致地监测这些类器官的形态发育过程,如图2所示。观察结果显示,从初始的iPSC集落(图2A)到早期类器官结构的出现(图2B),再到具有清晰边界的中期类器官(图2C),最终形成结构致密的成熟类器官(图2D-E)。

图 2:iPSC分化流程图及iPSC衍生的MO在分化和表征过程中的代表性图像。(A)iPSC集落:在最初阶段,iPSC形成紧密、致密的集落,表明处于未分化状态。(B)早期MO形成:早期MO显示出球形组织的开始,这是迈向复杂类器官发育的关键步骤。(C)中期MO发育:类器官结构变得更加清晰,呈现出更光滑和更均匀的外观。(D)高级MO生长:此阶段显示出明显更大且更不透明的类器官,表明细胞分化和类器官成熟已达到更高水平。(E)成熟MO:最终阶段显示了一个完全形成的中脑类器官,具有致密而均匀的结构。

本研究的核心在于广泛使用免疫染色分析来确定类器官的区域特性。未检测到FOXG1的表达(通常是前脑特异性标志物),表明在类器官的模式化或分化过程中不存在前脑特征。进一步的免疫染色研究显示了FOXA2(图3C)的表达,这是腹侧中脑发育的标志,以及成熟神经元标志物MAP2(图3F)的表达。同时,OTX2 的存在(图3B)表明了中脑-后脑边界的形成。

图 3:从iPSC衍生的3个月MO中脑标志物的免疫荧光表征。(A-C)关键神经标志物的免疫荧光染色,展示了类器官内细胞类型的多样性和神经结构的成熟度。FOXG1的缺失表明缺乏前脑发育。OTX2显示出强烈的红色荧光,表明存在特定于中脑-后脑边界的祖细胞。红色FOXA2突出显示了中脑腹侧区域以及类器官中多巴胺能神经元谱系的发育。青色MAP2揭示了成熟的神经元细胞结构,表明存在已停止分裂的神经元。DAPI用于染色细胞核。(D)样本中免疫染色的特异性,展示了TH 和DAPI的阳性对照与同型对照。同型对照证明了抗体特异性,无非特异性结合的现象。

在第90天时,类器官表现出多巴胺神经元标志物TH与成熟神经元标志物MAP2的共表达(图4),表明成功生成了与帕金森病研究相关的神经元类型。

图 4:从iPSC和hESC衍生的MO中脑神经标志物的免疫细胞化学分析。(A)一系列免疫荧光图像,显示了3个月iPSC衍生的MO中中脑标志物TH和成熟神经元标志物MAP2的表达。绿色荧光表示PAX6,标记了类器官内包含祖细胞的区域。(B)3个月hESC衍生的MO中TH和MAP2的表达。

通过单细胞RNA测序技术,进一步解析了3个月的类器官的细胞组成。统一流形逼近与投影(UMAP)图(图5A)基于基因表达有效地将细胞分类为不同的簇,揭示了包括多巴胺能神经元、少突胶质细胞和放射状胶质细胞在内的丰富多样的细胞类型。这表明类器官具有显著的细胞异质性和分化能力。UMAP图中显示出中脑标志基因EN1和LMX1A的阳性表达(图5B-C),进一步表明我们的分化方案成功引导了中脑谱系的形成。

图5:3个月iPSC衍生的MO的单细胞RNA测序分析。通过单细胞RNA测序分析揭示的3个月大MO中的细胞异质性。(A)UMAP可视化展示了不同细胞类型的明显聚类,这些细胞类型是基于其基因表达谱识别的。(B)UMAP可视化展示了EN1和Lmx1A基因的表达谱。(C)EN1和Lmx1基因的表达。

将中脑类器官解离后作为单层培养一个月,神经元表现出TH和多巴胺转运蛋白(DAT)的共表达(图6)。这一共表达表明从 iPSC 衍生的类器官中成功分化出了多巴胺能神经元类型。

图6:多巴胺能神经元中中脑神经标志物的免疫细胞化学表征。本图展示了一系列免疫荧光图像,突出了3个月iPSC衍生的DA神经元中中脑神经标志物TH和DAT的表达。DAPI被用来染色细胞核,显示为蓝色。

#4

实验步骤

Procedure

1. iPSC复苏

1.1. 基质涂层板和E8培养基的制备

(1)将基底膜基质小瓶放在冰上过夜解冻。使用冷却的Advanced DMEM/Ham's F12 DMEM/F12(1%的终浓度)将基底膜基质1:100稀释。长期使用时分装并储存在-20°C。

(2)将稀释后的基底膜基质在4°C解冻;每孔加1 mL溶液,涂覆在6孔板中。37°C孵育1 h。

(3)将涂层板从孵育箱取出,放置在室温下平衡。

注意:该板可在冰箱中储存最长2周(使用前确保恢复至室温)。为避免凝胶干涸,若长时间储存,可在涂层板上加1 mL E8培养基。

1.2. E8培养基的制备

(1)在无菌环境下,将E8基础培养基与E8补充液混合。

注意:该培养基可在4°C存放2周。解冻E8补充液时应在4°C过夜,不可在37°C解冻,因为这样可能会影响其稳定性。在使用前,只需将所需量的E8培养基加热至室温,直到其不再冰冷为止。

2. iPSC接种

2.1. 预热基质涂层板和E8培养基至室温或37°C孵育箱。

2.2. 吸去培养基,用不含钙镁的DPBS洗涤iPSC(6孔板每孔4 mL)。

2.3. 加入乙二胺四乙酸(EDTA,0.5 mM,每孔1 mL);在37°C下孵育,直到细胞群边缘脱落(约3-5 min)。

2.4. 吸去解离液;为分离细胞,使用比通常更强的吸力,用移液管将预热的E8培养基(每孔4 mL)直接加入细胞群,产生局部流体运动。

2.5. 以1:2的比例分配细胞,将其转移至新的6孔板中,每孔加入2 mL培养基。然后在37°C孵育。

2.6. 每天更换培养基,直到细胞群达到80%的融合度。

2.7. 使用10x放大镜观察细胞群,确保其大小合适,通常表现为明显的圆形,直径在0.5至1 mm之间。确认细胞群为致密、紧凑的结构,具有明显平滑的边界。

3. 神经诱导

3.1. 培养基准备和第0天设置

制备500 mL的CDM、神经诱导培养基(NIM)和神经干细胞无血清培养基(NSCSF)。使用DPBS(1x)(不含Ca2+/Mg2+)每孔4 mL洗涤6孔板中的细胞,然后添加NIM培养基(每孔3 mL)作为第0天。在第1、3、5天更换NIM培养基(每孔3 mL),并每天在显微镜下观察。在第6天,通过以下步骤将神经玫瑰花环转入悬浮培养:

(1)用DPBS(1x)(不含Ca2+/Mg2+)洗涤一次(每孔4 mL)。加入1 mL胶原酶IV,孵育1 min。去除胶原酶IV,轻轻用DPBS(1x)(不含Ca2+/Mg2+)洗涤一次(每孔4 mL)。

(2)每孔加入2 mL NSCSF培养基。通过刮取培养皿底部,用200 μL移液管制作网格,将细胞分离。

(3)将细胞悬浮液转移至10 cm无粘附培养皿中,用NSCSF培养基调整体积至12 mL。

(4)将无粘附培养皿放置在摇床(ssm1紧凑型轨道摇床)中,在37°C、5% CO2下以85 rpm的速度摇动,以防止细胞聚集。

4. 中脑模式化

4.1. 在第7天,添加12 mL的CDM(含有100 ng/mL的FGF-8b),并将其放置在轨道摇床孵育器中。

4.2. 在第8至13天,每2天更换一次培养基,并每天在显微镜下观察。

4.3. 在第14天,添加12 mL的CDM(含有100 ng/mL FGF-8b和1 μM PM)放置在轨道摇床中。

4.4. 在第15至20天,每2天更换一次培养基,并每天在显微镜下观察。

5. Matrigel包埋与MO终止和成熟

5.1. 在冰上将Matrigel解冻,温度保持在2°C到8°C之间,解冻1-2 h。

注意:解冻足够量的Matrigel,每个拟胚体(EB)使用15 μL。将Matrigel置于冰上,避免其早期聚合。使用前将所有接触Matrigel的塑料器具在-20°C下至少冷却30 min。

5.2. 将无菌的类器官嵌入板放入空培养皿中。

5.3. 使用宽口200 μL移液管,轻轻取出类器官并转移到嵌入表面,每孔放置一个类器官,直到12-16个EB被收集在嵌入表面。

5.4. 小心地去除每个EB的多余培养基,然后在每个EB上滴加15 μL冰冷的Matrigel。使用移液管将EB移至Matrigel滴液的中心。

5.5. 将培养板在37°C的孵育箱中孵育15至20 min,使Matrigel聚合。

5.6. 使用无菌镊子提起Matrigel滴液的嵌入板,将板直接悬空在6孔低粘附培养板的一个孔上。用移液管吸取3 mL含10 ng/mL BDNF和10 ng/mL GDNF的CDM,并轻轻地将Matrigel滴液从嵌入板转移到每个孔中。

5.7. 将培养板放置在37°C孵育箱中的轨道摇床上,85 rpm摇动,并每3天更换一次CDM(含10 ng/mL BDNF和10 ng/mL GDNF)。

注意:维持分化培养3个月;2周后神经形态开始显现。BDNF和GDNF在3个月后不再必要。

6. 免疫荧光染色

6.1. 使用1000 μL移液管轻轻取出类器官,将其放置在载玻片上,尽量减少培养基量。

6.2. 让其在室温下完全风干。加入4%的多聚甲醛(PFA)(每个样品300 μL)孵育30 min。

注意:PFA是有害的,可能具有致癌性。使用时要小心,避免直接接触皮肤和眼睛,并确保在化学通风柜中使用。

6.3. 向载玻片上添加30%蔗糖溶液(每个样品300 μL),并让其在4°C下过夜孵育。

6.4. 通过加入封闭缓冲液(BB)(每个样品300 μL)进行封闭和渗透,封闭液包括PBS(含Ca2+/Mg2+)、0.3% Triton X-100和10%的正常山羊血清,在室温下孵育2 h(或在4°C过夜)。使用疏水性边界笔在载玻片上划定类器官区域,并将缓冲液局限在样品区域。

6.5. 用适量的抗体(每个样品300 μL)在封闭缓冲液中覆盖样品,包括抗FOXG1(1:200)、抗OTX2(1:100)、抗FOXA2(1:100)、抗TH(1:100)、抗SOX2(1:100)、抗PAX6(1:100)、抗MAP2(1:500),并在4°C黑暗条件下孵育过夜。

6.6. 用1x PBS洗涤样品3 h,在轻轻摇动的工作台上进行两到三次缓冲液更换。

6.7. 使用二抗(每个样品300 μL)进行孵育,Alexa Fluor 488(1:800)、Alexa Fluor 594(1:800)和Alexa Fluor 647(1:800),并同时加入Hoechst 33342(1:5000)核染料,在4°C黑暗潮湿环境中孵育过夜。

6.8. 去除抗体,迅速用PBS洗涤,随后加入含0.01%叠氮化钠的PBS,在4°C孵育1-2天以防止污染。

6.9. 吸去PBS,去除多余的溶液,使用封片液将类器官封片。放上盖玻片,避免气泡形成,并在室温下的黑暗环境中存放至少12 h,以使封片液完全聚合。

注意:样品现已准备好,用荧光显微镜观察。

#5

材料

material

参考文献

Yangzom T, Chen A, Liang KX. Generation of 3D Midbrain Organoids from Human-Induced Pluripotent Stem Cells. J Vis Exp. 2025;(216):10.3791/67228. Published 2025 Feb 14. doi:10.3791/67228

往期推荐

武汉大学口腔医院尚政军团队高分综述:类器官技术如何帮助我们更好地理解口腔健康

【胰腺癌类器官】胰腺癌治疗中SHCBP1抑制剂AZD5582的潜在疗效

上海交大苏佳灿团队最新综述:骨/软骨类器官如何推动医疗创新?

复旦大学刘妍君/陈飞团队:血管化肿瘤类器官芯片助力肿瘤转移和靶向治疗评估

Science | 美国斯坦福大学团队证实,扁桃体类器官是开发更有效的流感疫苗的重要工具

IF 50+类器官技术揭示胰腺癌转移的关键密码:肌成纤维细胞可能是罪魁祸首

  • 发表于:
  • 原文链接https://page.om.qq.com/page/OI6qqQafYQ28q5qX6MUakkpg0
  • 腾讯「腾讯云开发者社区」是腾讯内容开放平台帐号(企鹅号)传播渠道之一,根据《腾讯内容开放平台服务协议》转载发布内容。
  • 如有侵权,请联系 cloudcommunity@tencent.com 删除。

相关快讯

扫码

添加站长 进交流群

领取专属 10元无门槛券

私享最新 技术干货

扫码加入开发者社群
领券