肠道微生物组的未来，还要看转录组

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近年来，肠道微生物组一直是研究的焦点之一。肠道微生物组不仅在基础研究中揭示了其对人体各器官系统的调节功能，同时在临床研究中也逐渐揭示了与多种疾病之间的紧密联系[1]。尽管人们已经对肠道微生物组的重要性有了深刻的认识，但其具体功能机制仍有大量未知领域需要探索。

早在2018年，微生物学家们就提出，研究微生物组不仅需要了解其组成物种，还需要运用多组学工具深入理解其细胞和分子功能[2]。在这些工具中，相对于基因组而言，转录组信息更全面地反映了微生物组的功能特征和变化，因此显得尤为重要。然而，值得注意的是，尽管宏基因组研究丰富多样，但是肠道微生物组的转录组研究却相对较为有限。这是为什么呢？除了宏基因组和宏转录组等传统工具外，是否还有新工具能够推动肠道微生物组研究取得更大的突破？

1肠道微生物组转录组：揭示功能的关键

肠道微生物组的转录组研究虽相对基因组研究而言较为有限，但这并非因为对转录组的需求不迫切。相反，肠道微生物组领域对于转录组研究的需求正在逐渐增强。虽然宏基因组提供了功能基因组分析的信息，但它只能告诉我们肠道微生物组“能做什么”。由于基因组中的基因不一定都会被转录，而即使被转录，其表达水平也可能存在巨大差异，因此我们需要转录层面的信息来了解肠道微生物组“在做什么”。

以2018年的研究为例，美国博德研究所的科学家们对炎性肠病患者的肠道微生物组进行了研究，发现在宏基因组水平上找到的菌种并不一定在转录水平上表达；甚至在转录水平上主导的菌种，并不一定是宏基因组数据中占比最大的菌种（图1）[3]。

图1. 入组受试者的肠道微生物组在RNA水平和DNA水平上的物种信息并不完全相同

由于转录水平的信息关乎“在做什么”，因此它还可以反映对环境刺激或变化的快速响应，这是基因组层面的信息无法提供的。例如，在细菌抗生素耐药性的发生过程中，在外部抗生素环境的刺激下，许多基因的表达水平会快速改变，需要在转录水平上才能发现并检测（图2）[4]。

图2. 大肠杆菌在抗生素处理后基因表达快速出现变化

同时，肠道微生物组的新理论假说，如倍受关注的 “肠X轴”（如肠脑轴、肠肝轴等，图3）[5]，提示了肠道菌群对人体各器官功能的影响。虽然这为我们提供了重要的线索，但这些机制的细节仍然模糊不清，需要在转录水平上对肠道微生物组功能机制进行更深入的挖掘。

图3. 肠道菌群对人体各器官和功能的影响

举例来说，2023年美国国立卫生研究院（NIH）在《Nature Microbiology》上发表了一项肠肝轴研究，分析了肠道菌群对丙肝感染引起的肝硬化的影响。该研究在转录水平上进行肠道菌群功能机制的分析，发现特定菌种中的脂肪酸合成及多糖降解功能会影响丙肝病毒感染后的肝纤维化（图4）[6]。

图4. 转录组数据揭示患者肠道菌群中与肝纤维化相关的功能通路

总体而言，随着我们对肠道微生物组重要性的认识不断深入，转录水平提供的功能相关信息变得愈发重要，对肠道微生物组转录组分析工具的需求也因此而升高。

2肠道微生物组转录组研究的难题：传统技术的局限

然而，在过去的十多年里，肠道微生物组转录组研究最常用的工具之一是宏转录组，有时也会使用微阵列（microarray）技术。这些工具固然有其优点，但也存在着一些限制，制约了肠道微生物组在转录组方向的深入研究。

在实际应用中，宏转录组最令研究者头痛的问题之一是如何准确判断每个测序片段的物种来源。由于宏转录组的检测对象是微生物组样本中所有细菌的总和，很难准确区分来源于不同物种的同源序列。尽管近年来有一些新的生物信息学分析方法对这个问题进行了改进，但并没有从根本上解决问题。

宏转录组面临的另一个局限在于其无法充分解析微生物群落内的功能异质性。 近年来的研究日益显示，即便是具有完全相同遗传背景的同一细菌种类，其功能上也存在显著的异质性，而抗生素的耐药异质性则为这一现象提供了明证[8-11]。在广谱抗生素的临床应用中，人体微生物组可能出现对抗生素的耐药性，这种变化并非以菌种或菌株为单位，而是在单个细菌水平上发生的（图5）。因此，从微生物群落的视角来看，这是一个高度异质的过程，同一菌种内可能存在同时耐药和敏感的细菌[8-9]。而宏转录组仅能呈现微生物群落转录组的整体水平，无法细致分析细胞内的异质性。

图5. 抗生素耐药异质性的发生过程

因此，肠道微生物组的转录组研究亟需一代新工具，以提高对测序片段物种来源的准确判断，并为微生物组中菌种/菌株内部的功能异质性提供精准的分析。这意味着需要细胞水平的转录组工具，以满足对微生物组转录研究更深层次的需求。

3单细菌转录组或将成为肠道微生物组研究利器

要在细胞水平对肠道微生物组进行功能分析，就不得不提到近年来问世的单细菌转录组技术。高通量单细菌转录组技术的出现为克服宏转录组的限制提供了新途径。在对测序片段的物种来源进行判断方面，单细菌转录组能够清晰地确定每个测序片段所属的细胞来源，从而有效区分来自不同细胞的同源序列，显著提高了转录组分析的便利性和准确性。在功能异质性的解析方面，单细菌转录组作为单细胞水平的分析技术，具有天然的优势。

近年来，涌现了多项单细菌转录组技术，包括一些高通量的方法，并且已经在菌群的功能异质性研究中取得了初步应用（图6）[10-13]。

图6. 单细菌转录组技术在细菌耐药异质性研究中的应用

然而，目前这些来源于文献的技术主要还是在人工培养的单克隆或混合菌中应用，尚未广泛应用于微生物组。尽管在微生物组的复杂性和应用难度方面存在挑战，但这一领域的商业产品中，M20 Genomics的M20 Seq以及基于这一技术的VITA GutMicrobiome产品凭借其独特性脱颖而出。作为唯一可应用于肠道微生物组的高通量单细菌转录组工具，VITA GutMicrobiome产品已成功应用于肠道微生物组的营养代谢功能异质性分析，展现出单细菌转录组技术在肠道微生物组研究中的巨大潜力。由于单细菌转录组技术的出现填补了宏转录组的局限性，加上肠道微生物组研究在转录组方向上仍存在大量空白，因此，肠道微生物组的转录研究前景备受期待。随着实验技术和分析方法的不断创新，单细菌转录组有望成为微生物组研究的新利器，为这一领域带来更丰富的成果。

参考文献：

1. de Vos WM, et al. Gut microbiome and health: mechanistic insights. Gut. 2022; 71(5): 1020-1032.
2. Heintz-Buschart A & Wilmes P. Human Gut Microbiome: Function Matters. Trends Microbiol. 2018; 26(7): 563-574.
3. Schirmer M, et al. Dynamics of metatranscription in the inflammatory bowel disease gut microbiome. Nat Microbiol. 2018; 3: 337-346.
4. Aunins TR, Erickson KE, & Chatterjee A. Transcriptome-based design of antisense inhibitors potentiates carbapenem efficacy in CRE Escherichia coli. PNAS. 2020; 117(48): 30699-30709.
5. Gebrayel, P., et al. Microbiota medicine: towards clinical revolution. J Transl Med. 2022; 20: 111.
6. Ali, R.O., et al. Longitudinal multi-omics analyses of the gut–liver axis reveals metabolic dysregulation in hepatitis C infection and cirrhosis. Nat Microbiol. 2023; 8: 12-27.
7. Shakya M, Lo CC, & Chain PSG. Advances and Challenges in Metatranscriptomic Analysis. Front Genet. 2019; 10: 904.
8. Stojowska-Swędrzyńska K, et al. Antibiotic Heteroresistance in Klebsiella pneumoniae. International Journal of Molecular Sciences. 2022; 23(1): 449.
9. Andersson, D.I., Nicoloff, H. & Hjort, K. Mechanisms and clinical relevance of bacterial heteroresistance. Nat Rev Microbiol. 2019; 17, 479–496.
10. Ma P, et al. Bacterial droplet-based single-cell RNA-seq reveals antibiotic-associated heterogeneous cellular states. Cell. 2023; 186(4): 877-891.
11. Xu Z, et al. Droplet-based high-throughput single microbe RNA sequencing by smRandom-seq. Nat Commun. 2023; 14(1): 5130.
12. Blattman, S.B., et al. Prokaryotic single-cell RNA sequencing by in situ combinatorial indexing. Nat Microbiol. 2020; 5(10): 1192-1201.
13. Kuchina, A., et al. Microbial single-cell RNA sequencing by split-pool barcoding. Science. 2021; 371(6531): eaba5257.