Nat Rev Chem｜靶向RNA的小分子方法

2024年1月26日，来自蔚蓝海岸大学联盟的尼斯大学、法国国家科学研究中心等机构的研究人员在Nature Reviews Chemistry上发表了题为Small molecule approaches to targeting RNA的综述。

鉴定RNA结合体的创新方法的开发引起了化学生物学和药物发现领域的极大关注。小分子是探索RNA生物功能和验证RNA作为治疗靶点的重要工具，尽管最近取得了一些进展，但要合理设计特异性RNA结合剂，还需要更好地了解RNA靶点与RNA靶点之间的相互作用，以达到预期的生物反应。

这篇综述讨论了如何应对这一尚未充分开发的化学领域所面临的挑战，以及与生物相关的RNA结合、相互作用并对其产生影响的最新策略。

摘要

寡核苷酸是研究RNA功能及其潜在治疗应用的重要工具，但由于药代动力学和药效学方面（如稳定性、选择性和生物递送等）的限制，其应用仍然有限。寡核苷酸的一些局限性已经得到解决，例如通过使用抗核酸酶的修饰核苷酸来提高稳定性。然而，其他一些限制仍有待解决，包括生物给药需要复杂的给药途径，因此适用性有限。与寡核苷酸互补的一种方法是使用小分子，这种方法在对RNA功能进行化学干预方面具有巨大潜力。

图1 RNA配体作为上市药物的历史回顾

最早的RNA结合剂是在20世纪40年代初发现的。随后，其他天然化合物也被确认为具有抗菌特性的核糖结合剂。最近，FDA批准了用于治疗脊髓性肌萎缩症的利斯地普仑（risdiplam），也彰显了RNA靶向的治疗潜力。此外，许多化合物可以作为为RNA结合剂，进一步加深了人们对小分子RNA靶向策略的理解。

设计RNA小分子

由于RNA的固有结构，识别RNA结合剂具有挑战性。第一个障碍是带高负电荷的骨架，它限制了兼容结构的数量。此外，与蛋白质的20个氨基酸相比，RNA只有四个核碱基，因此选择合适的化学骨架是设计适合RNA结合的配体的关键步骤。最后，与大多数蛋白质靶点不同，与生物相关的RNA根据碱基配对模式存在于动态的结构组合中。盐浓度、细胞内相互作用或突变等因素会影响某些亚结构的普遍性。改变这种动态组合可能会影响RNA的功能，而确定哪种RNA构象在体内具有生物活性仍是一项挑战。第三个主要缺点是难以预测化合物将与哪种结构异构体结合，以及这将如何影响RNA的功能。幸运的是，除了X射线外，结构生物学家现在还拥有一系列技术，如先进的核磁共振（NMR）和低温电子显微镜，这些技术应能为未来的重要发展提供工具。

在这些前提下，作为化学探针或潜在药物的选择性RNA结合剂的设计不能以与蛋白质靶向相同的方式进行。事实上，小分子与RNA的相互作用主要是氢键和π-堆积相互作用，在已报道的结合剂中，氢键和π-堆积相互作用占小分子与RNA识别相互作用的一半以上。疏水相互作用和弱氢键（如 CH-O相互作用）也是重要的相互作用，尽管其发生频率低于氢键和π-堆积相互作用。相反，小分子-蛋白质复合物中的相互作用主要表现为疏水接触，其次是氢键和π堆积。该领域取得的进展表明，很可能存在克服上述挑战的技术。然而，针对特定RNA靶点进行配体的合理设计仍然困难重重。

图2 基于氨基糖苷结构的RNA结合剂

利用阳离子配体提高选择性

带正电荷的化合物以选择性的方式与RNA相互作用，产生静电相互作用，这对结合非常重要。将这类化合物与能形成特定氢键和疏水相互作用的分子共轭，可提高选择性。因此，为了提高选择性，可以使用带正电荷的化合物接近RNA磷酸骨架，同时与能够形成特异性氢键或疏水相互作用的分子结合。

靶向二级和三级RNA结构

发现RNA结合剂的第二个挑战是RNA靶点的特殊化学空间与蛋白质不同。这就需要一种新的范式，可大致分为两类策略来设计选择性配体：(1) 在确定可与RNA结构形成特定相互作用的基础上合理设计结合剂；(2) 利用结合筛选、生物信息学和生物物理学的高通量方法来确定新的骨架。这些策略的成功在很大程度上依赖于对目标物二级和三级结构的透彻了解，这些结构在确定配体的潜在结合口袋方面起着至关重要的作用。

RNA粘合剂的设计方法

图3 针对二级结构的RNA粘合剂

对于第一种策略，二甲氨基嘧啶（图3a 中的化合物6）是一个很好的例子，在针对TAR 的Tat肽置换实验中，衍生物 7（对二甲氨基嘧啶的C5和C6位置进行迭代修饰，图 3a）比母体化合物6的活性提高了100倍。这表明在一个对Tat相互作用特别重要的位点有更强的结合力。

在三氨基三嗪分子中也发现了类似的相互作用，三嗪杂环的两个边缘可以与配对不佳的尿嘧啶和胸腺嘧啶残基形成全套的杰纳斯-楔形氢键（图3b）。添加双脒沟结合连接体（如化合物 9-11（图3c））后，就能制备出针对DNA和RNA三重重复扩展的多聚体化合物。这些现象与许多遗传疾病有关，因为它们会诱导产生异常蛋白质。脒基的存在还增加了与双螺旋主沟中磷酸骨架的静电相互作用。

同样，萘啶骨架也被用于设计DNA和RNA分子胶。该片段可与未配对的鸟嘌呤和胞嘧啶碱基形成特定的氢基键（图3e）。二聚体被制备出来，用于控制两条单链DNA和高阶RNA结构之间的杂交可能。

通过高通量方法找到RNA结合体

在第二类基于高通量技术的靶向方法方面，一项引人注目的研究报告称，利用高通量测序与传统SELEX（通过指数富集配体的系统进化）方法的整合以及生物信息学分析，确定了pre-miRNA的发夹环序列，该序列对水溶性环状错配结合配体15显示出很高的结合亲和力和特异性，该配体能够与未配对的G残基发生选择性相互作用（图3f）。

ribocil（化合物16，图3g）是具有类似药物特性的特异性RNA结合剂。作为黄素单核苷酸（FMN）核糖开关的抑制剂，ribocil针对的是这些与特定内源配体结合后可调整基因表达的原核RNA。FMN核糖开关调节核黄素浓度，并控制与其生物合成和运输有关的基因。高通量筛选结果表明，核黄素核糖开关的S对映体是一种有效的FMN抑制剂，可降低大肠杆菌中核黄素的含量。

高通量与合理策略的结合

基于潜在相互作用的全新设计和高通量方法都是发现精选配体的有效策略。对RNA结构的了解越多，对相互作用的设计和理解就越好。因此，将所有这些方法结合起来，将是未来发现高效RNA结合剂的理想选择。

最接近根据目标结构合理设计RNA配体的方法是InfoRNA方法，它属于最近开发的一系列发现工具。尽管这些方法中的大多数，如动态组合化学或DNA编码文库，仍在探索之中，但InfoRNA在发现新的结合剂方面发挥了至关重要的作用，这些结合剂已在体外、细胞内和体内得到验证。

Hoechst衍生物的核心是苯并咪唑骨架，它是著名的荧光团，能通过插入作用与核酸相互作用，在InfoRNA鉴定出的许多RNA结合剂中都发现了这种骨架。一个典型的例子是化合物18（图3h），它被鉴定为miR-210发夹前体的特异性结合剂。

结合不同技术来优化RNA配体和了解潜在分子机制是非常重要的（图3i，3j）， InfoRNA是识别具有高特异性生物活性的RNA结合体的合适方法。细胞内活性还与RNA靶点直接相关，通过靶点结合实验确认是哪种细胞内RNA导致了这种活性。活性的体内确认进一步突出了InfoRNA的有效性。

靶向动态三维RNA结构

成功的相互作用取决于靶点的三维环境和RNA构象适应的潜力，从而产生特定的结合位点。因此，了解相关的三维结构对于发现新配体至关重要。靶点的二级和三级RNA结构与形成结合口袋所涉及的配对相互作用密切相关。在大多数情况下，RNA靶点具有不止一种可能的构象，而构象对其功能至关重要，这进一步增加了研究的复杂性。另一方面，结合可能涉及诱导配合机制，也可能涉及构象选择机制，这就使设计适合特定靶点的配体更具挑战性。因此，结构生物学、生物化学、生物物理学和分子建模是设计高效结合剂的重要领域。即使有算法可以预测RNA碱基配对和由此产生的结构，实验验证对评估其可靠性也至关重要。

图4 确定RNA结构的核磁共振和SHAPE方法

核磁共振仍然是评估RNA结构和配体结合的重要技术。方法主要基于对目标核或配体H核的观察，它们已被开发用于研究RNA动态（检测动态子态）和RNA与配体的相互作用。核磁共振研究有助于阐明利斯地普仑的作用模式（图4）。

人工智能增强的分子模拟与SHAPE-MaP等实验技术相结合，最近也被用于评估RNA动态和配体结合事件的可预测性。这种方法能以可靠的方式突出哪些核苷酸对配体解离至关重要。否则，这些相互作用将很难识别，因为它们远离结合位点，不会与所研究的配体直接相互作用。

其他结构生物学方法，特别是晶体学和低温电子显微镜，可用于更好地了解目标物的三维结构及其动力学，但它们很少能单独解释特定RNA的整个构象。因此，重要的是要综合使用各种方法，以实现为目标生物产出的功能结构鉴定特定配体的目标。

RNA结合的新模式

近期的研究策略使配体的设计具有了更强的功能，如共价结合或裂解特性，这主要是受靶点鉴定和验证的需要所驱动。这方面的一种有效方法是化学交联和下拉分离（Chem-CLIP）（图5a、b、c、d）。该方法证明在完整的生物系统中研究小分子与RNA的相互作用是可行的。此外，基于共价或裂解分子与RNA配体共轭的例子说明该方法不仅在靶点验证研究中具有价值，而且在不影响选择性的情况下还能提高实际生物效应。

图5 通过附加功能实现RNA结合

从这些发现和观察出发，RNA靶向领域最近的一项创新是开发核糖核酸酶靶向嵌合体（RIBOTACs）。这些嵌合体涉及将特定的RNA配体与激活RNase L（一种RNA降解酶）的分子共价连接（图5e），这种方法已应用于各种RNA结合体。细胞内荧光素酶报告实验证明，RIBOTAC策略的优化增强了化合物的生物活性。这种将化学修饰和各种检测方法合理结合的方法，有助于鉴定出有效靶向细胞而不产生毒性的特异性配体。这些复杂工具在体内的适用性问题仍未解决，但迄今报道的大量实例表明，有望以类似于PROTACs的方式取得进一步发展。将配体的RNA结合特性和选择性与具有共价和/或裂解特性的化学工具相结合，无疑是一种有趣的化学生物学和药物化学应用方法。这些杂多功能分子的发现摆脱了人们普遍接受的类药物特性，其最新进展要求灵活运用经典的 "5规则"，以实现可能有益于治疗发现的新模式。

总结和展望

本综述探讨了近年来将RNA作为生物靶点的设计策略和化学方法。最重要的悬而未决的问题是缺乏一种标准的方法来获得RNA靶向小分子所需的特定生物效应。尽管进行了相关的体内研究并取得了一些临床成功，但许多已报道的配体缺乏细胞和体内特异性的证明，也缺乏观察到的生物效应与所需RNA的特异性靶向之间的相关性。因此，还需要进一步的研究，特别是靶点验证实验、结构生物学研究以确定靶点的实际构象和结构，以及生物活性的体内验证。此外，很难区分纯RNA结合剂、RNA蛋白抑制剂或RNA蛋白结合剂在生物环境中诱导的生物活性。这当然适用于所有生物活性分子，但在RNA标记领域尤为明显。对相互作用位点的深入研究以及对这些位点的准确选择，是达到预期活性的基本参数。人工智能在发现RNA结合剂方面的应用已有报道，很可能会继续在这一领域发挥作用。

本文介绍的工具，包括针对RNA一级、二级和三级结构的化学策略，以及了解RNA结合、功能和生物学结果的创新方法，是下一步工作的主要基础：针对具有强大生物活性的特定靶标合理设计配体。这将有助于创造新的方法来回答复杂的生物学问题，并为治疗开辟新的途径。未来几年将是决定性的几年，它将证实这一领域的乐观看法是否准确。

参考资料：

https://doi.org/10.1038/s41570-023-00569-9