Nature｜利用冷冻电镜技术架起结构生物学与细胞生物学的桥梁

2024年4月3日，来自加利福尼亚大学的Eva Nogales和德国海德堡欧洲分子生物学实验室（EMBL）的Julia Mahamid联合在Nature上发表综述：Bridging structural and cell biology with cryo-electron microscopy。

本综述探讨了通过单粒子冷冻电子显微镜（cryo-EM）和冷冻电子断层扫描（cryo-ET）这两种姊妹方法对冷冻分子和细胞进行的研究。本综述试图从现在和未来的角度，探讨如何通过不同的电子显微镜方法组合来观察冷冻保存的具有不同复杂程度的生物样本，从而使我们更接近我们的终极梦想，即了解大分子如何在细胞内运作，从而产生生物世界的适应性和反应复杂性。

背景

冷冻电子显微镜的出现极大地促进了对大型功能复合物以及一般难以表达、纯化和/或结晶的样品的研究。尽管如此，冷冻电子显微镜仍然需要优化，因此需要在大分子运行和共存的自然环境之外进行可视化。相反，细胞生物学家一直在使用一些快速发展的技术为细胞成像，这些技术不断扩大其空间和时间范围，但仍达不到理解化学的分辨率。因此，结构生物学和细胞生物学为细胞的内部运作提供了互补但又互不关联的视角。

正文

在过去的十年中，cryo-EM方法的改进提高了其通量、适用性和分辨率，极大地增强了其所能提供的生物学洞察力。与此同时， cryo-ET也开始克服细胞研究中固有的一些技术障碍：需要制作薄样品，在保持可承受电子剂量的情况下，倾斜样品的图像质量受到影响，后续断层扫描重建的分辨率有限，或由于细胞致密复杂的特性，信噪比低，细胞体积的可解释性受到限制。

这两种技术可以相互促进，从而提供比各部分之和更多的生物洞察力。我们在此提出一些可以协同使用的方法，以便在研究某一生物过程时获得机理信息。

cryo-EM和cryo-ET的技术进步

在过去十年中，多项技术突破改变了cryo-EM和cryo-ET的功能。对这两种方法影响最大的是更好的探测器技术发展和商业化。直接电子探测器（DED）极大地提高了图像的对比度和分辨率。数据采集的自动化和现代显微镜光学系统的进步也提高了所获图像的质量和数量，并使cryo-EM的适用性和分辨率大大提高。对于完整细胞的cryo-ET来说，数十年来的主要瓶颈一直是将样品减薄至电子透明，而材料科学领域常用的聚焦离子束（FIB ）铣削技术最终为冷冻样品提供了一种基本的常规解决方案。

与硬件进步同样重要的是新软件平台的开发。新的机器学习方法也在应对描述大分子连续构象变化的挑战，有可能为复杂的构象景观提供新的见解，而复杂的构象景观往往是大分子功能的核心。

cryo-EM和cryo-ET中样品的复杂性

研究样品的性质最终决定了使用哪种成像技术。假定研究对象在组成和构象变化方面比较简单：例如，纯化的核糖体通常是cryo-EM的研究对象。相反，细胞内多聚体中核糖体的高阶组合将通过cryo-ET成像。这一推理让我们回到了最初的观点，即cryo-EM是一种更"经典"的还原论结构生物学方法，而cryo-ET则有望对细胞内部进行成像。然而，样本的复杂性几乎是一个连续统一体；这一范围必然会对简单的区分提出挑战，并模糊了何时可以使用一种方法或另一种方法的界限。

图1 用一系列cryo-EM方法表征不断增加的样品复杂性

传统的样品纯化

cryo-EM对样品浓度的要求很低，这意味着可以依靠内源性纯化的材料进行结构研究。一般的策略是CRISPR工程细胞系，在该细胞系中，相关复合物的一个亚基已被染色体标记，以便进行亲和纯化。然后可通过不同形式的"亲和格栅"将样本浓缩以进行成像。而纯化的多形性样品，如包膜病毒或化学计量不明确的核糖核颗粒，通常更适合cryo-ET表征。

复杂的重组

当由纯化成分重组的系统因分子部分的数量和/或这些部分的独特排列而变得复杂时，可能需要使用非难处理的定制单颗粒方案来处理这种复杂性，或使用cryo-ET进行子图平均和分类。同时收集两种模式的数据并对这些数据集进行分析，以便对所得到的结构进行系统比较和解释，可能会被证明是在某些最复杂的重组系统中获得功能性结论的最可靠方法。

粗提纯

现在可以只处理部分纯化的材料，并从高度复杂混合物的单个网格或数据集中同时对多个大分子进行冷冻电镜重建。这类方法面临的挑战是，在没有或几乎没有关于单颗粒cryo-EM图像的结构知识，甚至不知道应该有多少结构存在的情况下，如何根据不同的结构对单颗粒cryo-EM图像进行分组。目前，在生成初始模型的早期阶段，如果没有人工干预，就无法可靠地完成这一过程。在这种情况下，一种可能的方法是从相同的样品网格中获取cryo-ET数据来生成初始模型。相位板等能最大限度提高信号的成像方案可能有利于简化从cryo-ET生成初始模型的过程，从而可用于复杂混合物的cryo-EM分析。

细胞组分

几十年来，提取物和细胞组分已被广泛用于阐明细胞通路。在透射电子显微镜下进行冷冻电镜成像时，提取物的优势包括克服了生成薄细胞切片的瓶颈，以及有机会对提取物进行操作，通过在细胞培养系统中过表达或外源添加，去除成分或添加成分。在后一种情况下，添加的关键成分可以用荧光标记，这样就可以用相关的光学和电子显微镜（CLEM）方法进行跟踪，甚至可以用电子致密标记物标记，以便在cryo-EM中直接识别。相反，使用细胞提取物则是一种折中方法，其解释难度可能与原位研究相同，但却失去了真正的细胞背景。一般来说，这些系统可能需要通过cryo-ET进行研究。

使用完整细胞

在许多情况下，解决生物问题需要直接观察细胞或组织。根据生物物体的原始厚度，可采用传统的跌落式冷冻或高压冷冻，其理想的信噪比分析样本厚度必须小于0.3微米（最好是0.3微米的一半）。这些薄片或薄层将被导入透射电子显微镜，并通过cryo-ET成像，这是最常见的方法。

提取复杂样品中的信息

当样本的复杂性或性质需要cryo-ET时，冷冻图谱通常要经过去噪、分割和/或定位最明显的元素后才能解读。细胞环境中相关结构的识别可通过计算模式识别来完成，并通过传统的交叉相关、有监督的深度学习或无监督算法（仍需大量开发和验证）与断层图进行匹配。另外还有两种基于标记相关成分的粒子识别方法：1）使用荧光标记复合物的相关光镜和电子显微镜；2）使用分子标签，直接精确定位冷冻图谱中相关复合物的位置。

图2 cryo-ET将复杂的细胞生物学可视化

与cryo-EM相比，cryo-ET的吞吐量有限，不过最近的发展极大地提高了断层图像的采集速度。目前，最先进的cryo-ET的各种应用，以及与相关方法的结合，已经为复杂的细胞生物学提供了前所未有的洞察力。

cryo-EM和cryo-ET之间的相互作用

cryo-ET和cryo-EM是相辅相成的。cryo-EM是解释从更复杂系统中得到低分辨率cryo-ET图的理想方法。cryo-EM研究的分子尺寸较大，通常可提供多种功能状态，这使其具有优势，而且cryo-EM生成的结构可随时用于解释复杂的cryo-ET重建。

两者相结合的一个方法是使用cryo-EM结构作为模板，搜索断层体积并确定相应分子在细胞环境中的位置。该方法的缺点是可能无法获得精确的高分辨率结构，优点是，如果蛋白质数据库中存在这种结构或可以通过计算生成这种结构，那么该方法甚至能够区分每个对象实例的不同构象状态（而无需求助于平均化和分类）。

超越cryo-EM和cryo-ET

要将cryo-EM或cryo-ET获得的分子水平结构与细胞和生物体水平的功能联系起来，还需要进一步开发冷冻水合样本的大容量成像方法，然后再进行FIB铣削和/或提取特定切片，以便进行后续的cryo-ET研究。这种方法已经开始出现，并将在未来几年逐渐成熟。最后，随着cryo-ET方法在多个方面向更高通量方向快速发展，可以通过整合多组学单细胞数据对其进行补充，以揭示细胞间生物过程的优美变异性和随机性。当与纯化大分子复合物的cryo-EM高分辨率结构相结合时，必将对细胞过程及其调控产生新的机理认识。

结构数据库促进了变革性蛋白质结构预测的出现，并在结构生物学领域掀起了一场风暴。AlphaFold或RosettaFold等人工智能方法现在所能做到的，已经将结构预测提升到了一个全新的水平。人工智能蛋白质结构预测可以成为强大的盟友，提高结构生物学的研究范围和速度。显而易见的是，如今从基于人工智能的预测到大型组装体的cryo-EM实验结构，以及从分子结构角度解释cryo-ET捕获的细胞内视图的引导路径已成为现实。

参考资料：

Nogales, E., Mahamid, J. Bridging structural and cell biology with cryo-electron microscopy. Nature 628, 47–56 (2024). https://doi.org/10.1038/s41586-024-07198-2

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