三代测序100问（16）：纳米孔测序平台自适应采样技术的原理

随着三代测序技术的深入发展，研究者的目光已不再仅仅满足于获取基因组的序列信息。一个日益增长的需求是，如何在对特定基因组区域进行测序的同时，完整地保留其天然的碱基修饰？最近，李老师就遇到一位老师提出这样的设想：“我想对人类基因组的特定区域进行靶向测序，并同时分析其DNA甲基化，三代测序技术能实现吗？”

答案是肯定的。而实现这一目标的“黑科技”，便是牛津纳米孔（ONT）测序平台独有的自适应采样（Adaptive Sampling）技术。今天，我们就来深入解析这一堪称“读心术”的技术，看看它是如何实现对目标DNA的“智能筛选”的。

传统靶向富集的“两难之境”

在探讨自适应采样之前，让我们先回顾一下传统的靶向测序富集方法。通常，研究者会采用两种策略来富集感兴趣的区域（Regions of Interest, ROIs）：

1. 探针捕获（Probe Capture）：设计并化学合成一系列与目标区域互补的探针，通过液相杂交将目标DNA片段“钓”取出来。
2. 靶向扩增（Targeted Amplification）：针对目标区域设计特异性PCR引物，通过扩增来大量富集目标片段。

这两种方法虽然成熟有效，但都面临着一个共同的“两难之境”。首先，它们都需要事先设计并合成物理的探针或引物，这不仅步骤繁琐，增加了额外的实验时间和经济开销，而且一旦目标区域需要调整，就必须重新设计和订购。

更致命的是，无论是探针捕获后的文库构建，还是靶向扩增本身，都不可避免地涉及到PCR过程。正如我们之前讨论过的，PCR会抹去DNA上所有天然的碱基修饰信息（如5mC、5hmC等），使得我们无法在测序后探究这些区域的表观遗传学特征。

自适应采样：在测序中完成“实时富集”

纳米孔测序的自适应采样技术，则彻底颠覆了这一“先富集，后测序”的传统模式。它是一种在测序过程中（on-the-fly） 完成的计算驱动型富集方法。

• 常规测序模式：在传统的过孔测序中，测序仪像一个开放的通道，无差别地接受所有进入纳米孔的DNA片段。最终能读到什么序列，完全取决于该片段在文库中的相对丰度。
• 自适应采样模式：该模式下的测序仪则化身为一个拥有“自主意识”的智能筛选器。它的工作思路如下： a. 设定目标（The "Guest List"）：在测序开始前，研究者只需将目标区域的序列信息（通常是一个FASTA或BED文件）输入到控制软件中。 b. 实时识别（The "ID Check"）：当一条DNA分子在马达蛋白的牵引下开始进入纳米孔时，系统会实时采集其产生的电流信号。强大的算法可以在该分子的前几十到几百个碱基刚刚通过时，就对其进行超快速的碱基识别（basecalling）和比对。 c. 决策与执行（The "Gatekeeper's Action"）： ■ 如果匹配：算法判断这段“前瞻”序列属于预设的目标区域，测序将正常继续，完整读取该分子的全长序列。 ■ 如果不匹配：若算法判定该分子为非目标序列（背景DNA），系统会立即施加一个反向电压。这个操作会瞬间改变孔内的电场方向，将这条正在进入的DNA分子“弹出”或“拒绝” ，让纳米孔迅速恢复空闲状态，准备迎接下一条分子的到来。

技术优势：化繁为简，信息完整

简单概括，自适应采样技术的核心优势在于：

• 摆脱湿实验：它彻底摆脱了实验捕获或扩增目标区域的繁琐步骤，将富集过程从实验台转移到了测序仪内部。
• 成本与时间效益：只需预先设定目标序列，依靠信号处理和算法在硬件运行中即时完成富集，极大地节省了额外的探针/引物开销和实验时间。
• 保留完整表观信息：最关键的是，这是一个完全PCR-Free的富集过程。因此，被选中的目标DNA分子上的天然碱基修饰信息得以完整保留，实现了在同一条read上同时获得序列和修饰信息的“一石二鸟”效果。

结语

这一期，我们一同了解了纳米孔自适应采样技术的基本原理。它将测序仪从一个被动的“记录者”变成了一个主动的“筛选者”，为靶向测序，特别是靶向表观遗传学研究，开辟了全新的道路。

关于自适应采样的具体应用场景、性能表现以及实验设计中的注意事项，我们将在后面的节目中单独为大家进行更详细的讲解。好了，这一期节目就到这里，我们下期再见！