Nat Chem Biol丨汤玮欣研究组与可爱龙课题组联合开发增强型enOgeuIscB/ωRNA系统

引言

CRISPR-Cas9在基因编辑中的广泛应用极大地推动了基因治疗等技术的发展。然而，Cas9蛋白尺寸较大，给其在体应用中的药物递送带来很大的挑战。IscB是一类由ωRNA向导的可编程核酸内切酶，被认为是Cas9的祖先蛋白。它含有Cas9所有的重要蛋白结构域，包括高度保守的HNH和RuvC双酶活结构域，以及串联RuvC的螺桥（bridge helix）。结构研究表明，IscB与Cas9在DNA靶点识别、R-loop形成、HNH酶切机理等方面具有高度的相似性。OgeuIscB发现于人体肠道宏基因组，其大小只有496个氨基酸，约相当于SpCas9的1/3。高度紧凑的特点使得OgeuIscB在基因编辑等潜在的治疗应用中具有极大的递送优势，因此受到人们的广泛关注。然而，野生型OgeuIscB的活性非常弱，其在基因组DNA上的靶向选择性尚不明确，这些因素限制了它在基因编辑等研究中的应用。

近日，美国芝加哥大学汤玮欣研究组与康奈尔大学可爱龙研究组（已迁往耶鲁大学）联合在Nature Chemical Biology杂志在线报道了题为Assessing and engineering the IscB-ωRNA system for programmed genome editing的研究。该研究通过理性设计等蛋白工程化手段与基于结构的RNA改造，分别对OgeuIscB蛋白与ωRNA进行了优化，开发了一种增强型enOgeuIscB/ωRNA系统。

该系统对DNA的识别结合能力较野生型得以显著提高，其在人体细胞中对基因组DNA的程序化插入与删除率也由低于2%提升至最高达87%。enOgeuIscB与腺苷脱氨酶的融合可对DNA碱基实现A:T到G:C的定点编辑，最高达62%。

(Credit: Nature Chemical Biology)

为探明enOgeuIscB/ωRNA系统的靶向选择性，作者进行了GUIDE-seq实验。结果表明，enOgeuIscB/ωRNA系统在人类基因组上存在一定的脱靶效应。对脱靶位点的进一步统计分析研究发现，该系统对靶序列的选择性主要取决于其对NARR型靶点邻近序列（TAM）的偏好，以及对R-loop中邻近TAM的14个核苷酸序列的高度识别。

综上，该研究表明工程化改造的enOgeuIscB/ωRNA系统具有精小、可程序化、高效、选择性基因组DNA编辑等特性。这些成果为将来OgeuIscB/ωRNA系统活性的进一步优化提升及其在疾病治疗中的潜在应用提供了重要的基础，也为其它CRISPR-Cas系统的工程化改造带来了启示。

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