【百欧泰生物】甲基化单克隆抗体制备：推动生物医学科研进展

【百欧泰生物】甲基化单克隆抗体制备：推动生物医学科研进展

甲基化单克隆抗体是专门针对甲基化位点或甲基化相关蛋白表位产生特异性免疫反应的单克隆抗体。其优势突出，特异性极高，仅识别甲基化状态，能有效排除其他非甲基化物质的干扰；灵敏度出色，可检测低浓度甲基化目标。在应用上，在科研领域，用于深入研究基因甲基化对细胞功能、发育及疾病发生的影响，解析表观遗传调控网络；临床方面，可作为癌症等疾病的早期诊断生物标志物，辅助监测疾病进展与预后；药物研发中，助力筛选甲基化靶向药物及评估疗效，推动精准医疗发展。

甲基化单克隆抗体制备：从抗原设计到抗体纯化

1. 抗原设计与合成

1.1 抗原设计

确定甲基化位点及序列：通过生物信息学分析、查阅相关文献或前期实验数据，确定目标蛋白或核酸上的甲基化位点。围绕该位点选取一段长度适宜（通常 10 - 20 个碱基或氨基酸）且具有特异性的序列。

添加辅助元件：为增强抗原性，可在序列两端添加一些辅助氨基酸或化学基团。

1.2 抗原合成

多肽抗原合成（若为蛋白质相关甲基化）

选择合成方法：常采用固相合成法。将第一个氨基酸的羧基端连接到固相载体（如聚苯乙烯树脂）上，然后依次将其他氨基酸按照序列顺序进行偶联反应。在涉及甲基化氨基酸的步骤，使用特殊的甲基化试剂对相应氨基酸进行修饰。

核酸抗原合成（若为 DNA/RNA 甲基化）

化学合成法：利用 DNA/RNA 合成仪，按照设计好的甲基化核酸序列，将核苷酸逐个添加。在需要甲基化的核苷酸添加时，使用甲基化修饰的核苷酸单体。反应过程中严格控制试剂浓度、反应时间和温度等参数，以确保合成的准确性和效率。

2. 动物免疫

2.1 选用 BALB/c小鼠进行免疫。初次免疫时，取100-200微克甲基化抗原与等体积的弗氏完全佐剂充分乳化后，采用皮下注射的方式，在小鼠背部多点注射，总注射量约为200-400微升。

2.2 初次免疫后2-3周进行第一次加强免疫，使用50-100微克抗原与弗氏不完全佐剂乳化，腹腔注射20-300微升。

2.3 再过2-3周进行第二次加强免疫，抗原剂量同第一次加强免疫，可选择皮下或腹腔注射。

2.4 在每次免疫后的7-10天，从小鼠尾部取血，通过酶联免疫吸附测定检测血清中抗体效价，当效价达到一定水平时，可考虑进行细胞融合。

3. 杂交瘤细胞融合与筛选

3.1 细胞准备

取加强免疫后血清抗体效价较高的小鼠脾脏，在无菌条件下制备脾脏细胞悬液，细胞浓度约为 1×108-5×108个/毫升，一般可获得约 1×108-2×108个脾脏细胞。

选择合适的骨髓瘤细胞系（如SP2/0细胞），在对数生长期收集，细胞浓度调整为1×107-2×107个/毫升，取约1×107-2×107个骨髓瘤细胞。

3.2 融合过程

将脾脏细胞与骨髓瘤细胞按5:1-10:1的比例混合，在37℃水浴中缓慢滴加1-2毫升50%聚乙二醇（PEG）溶液（分子量1500-4000），边滴加边轻轻搅拌，作用1-2分钟后，缓慢加入10-20毫升无血清培养基终止融合反应，离心收集融合后的细胞。

3.3 筛选

将融合细胞重悬于含20%胎牛血清、1%HAT的选择性培养基中，接种于96孔细胞培养板，每孔约200微升，细胞密度约为1×105- 5×105个/孔。在 37℃、5% CO2培养箱中培养7-14天，期间观察细胞生长情况，及时更换培养基。培养结束后，通过ELISA筛选出能分泌特异性甲基化单克隆抗体的阳性杂交瘤细胞克隆。

4. 抗体的大规模生产与纯化

4.1 体外培养

将筛选出的阳性杂交瘤细胞株在体外进行大规模培养，可采用悬浮培养或生物反应器培养。在悬浮培养时，初始接种细胞密度约为1×105-1×106个/毫升。培养过程中，根据细胞生长情况适时添加新鲜培养基，维持细胞密度在1×106-5×106个/毫升。培养一段时间（一般5-7天）后，收集培养液，通过离心去除细胞碎片等杂质。

4.2 体内生产

将阳性杂交瘤细胞接种到小鼠腹腔内进行体内生产。每只小鼠腹腔注射约5×105-1×106个杂交瘤细胞。抽取腹水，进行抗体纯化。

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参考文献

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