动物模型构建与评估丨电凝法与线栓法制备大脑中动脉缺血模型

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《动物行为实验指南》共674页，涵盖了常见的实验动物，如小鼠、大鼠和斑马鱼，详细描述了每一种行为测试的实验设计、测试设备、实验流程、评估指标、预期结果、常见问题及解决方法、数据分析、模型应用与局限性等各个方面。它通过快速引导，帮助研究人员高效地掌握实验的每个阶段，减少了查阅文献和寻找方法的时间，成为各类科研人员的重要参考资料。

《动物行为实验指南》共计收录了16种动物行为类型，包括焦虑抑郁、学习记忆、痛觉、运动、恐惧、社交、癫痫、操作、成瘾、视觉、痒觉、味觉、嗅觉、睡眠、斑马鱼行为以及常见动物模型等内容。每一类动物行为下，都详细介绍了多个经典的实验范式，涵盖了超过100种实验方法。

对于脑缺血,已应用于立脑卒中后中枢痛(centralpost-stroke pain, CPSP研究的模型包括线栓法大脑中动脉缺血模型、内皮素注射模型、光化学血栓诱导缺血模型等。其中,线栓法模型在术后可出现双侧痛觉超敏反应;内皮素注射模型模拟了CPSP的迟发性热痛觉超敏反应,但并未观察到机械性超敏反应;光化学血栓法术后可观察到热痛阈和机械性痛阈降低,但此模型源于微血管损伤,更类似于创伤性脑损伤模型。基于现阶段仍未有既能模拟临床卒中又符合CPSP临床表现的脑缺血动物模型,本实验选用经典的大脑中动脉缺血模型中的电凝法远端大脑中动脉栓塞(distal middle cerebral artery oc-clusion, dMCAO)和线栓法短暂大脑中动脉栓塞(transient middle cerebral artery occlusion, tMCAO)分别构建小鼠模型,从神经功能、梗塞体积、机械性缩足阈值、热缩足潜伏期和运动功能几方面对两种模型进行对比,以期找到与临床CPSP表征更为相符的动物模型。

线栓法制备大脑中动脉缺血模型:

造模前小鼠禁饮禁食12h,采用1.5%戊巴比妥钠(5mL/kg)腹腔注射麻醉,将小鼠置于恒温加热毯上仰卧固定,常规备皮消毒。经颈正中切口入路,充分暴露右侧颈总动脉、颈内动脉和颈外动脉,在颈外动脉近心端处做切口,置入硅胶线栓,剪断并向下翻折颈外动脉使颈外动脉和颈内动脉成一条线,推动硅胶线栓进入颈内动脉,堵塞大脑中动脉,30min后取出硅胶线栓。缝合皮肤并消毒,将小鼠置于恒温加热毯上,待麻醉苏醒后放回笼盒。

电凝法制备大脑中动脉缺血模型:

造模前小鼠禁饮禁食12h,采用1.5%戊巴比妥钠(5mL/kg)腹腔注射麻醉,将小鼠置于恒温加热毯上右侧卧位固定,常规备皮消毒。沿小鼠左眼外眦与同侧外耳道之间连线做约1cm切口,分离颞肌暴露颅骨,颅骨钻打磨后暴露大脑中动脉远端“Y”型分支,用电凝笔将“Y”型的三端分别电凝,使血管充分闭塞,1min后观察血管是否再通,如无再通说明电凝成功。缝合后充分消毒,将小鼠置于恒温加热毯上,待麻醉苏醒后放回笼盒。  

左:电凝法dMCAO造模示意图,电凝阻塞左侧大脑中动脉远端分支,形成缺血;右:线栓法tMCAO造模示意图,线栓从右侧颈内动脉进入,阻塞大脑中动脉起始端,形成缺血。

Fig1 造模示意图

神经功能缺陷评估

采用Longa评分对造模小鼠进行神经功能缺陷评估。0分,无神经功能缺陷,肢体活动正常;1分,轻度的局限性神经功能缺陷,偏瘫侧前爪不能正常伸展;2分,中度神经功能缺陷,行走时向偏瘫侧转圈;3分,重度神经功能缺陷,行走时向偏瘫侧倾倒;4分,不能自行行走,存在意识丧失现象。

机械性缩足阈值(paw withdraw threshold, PWT)

采用Von Frey细丝法测定小鼠机械性缩足阈值,判断造模后机械性痛阈。测试时将小鼠放入塑料隔间中适应至少30min,用Von Frey细丝的尖端(0.02、0.04、0.07、0.16、0.40、0.60、1.00g)垂直刺激小鼠后爪足底,注意避开小鼠足底肉垫,从Von Frey细丝最小值(0.02g)开始测试,每级克数的刺激维持5s左右;若5s内小鼠出现抬爪、舔爪、抖爪或缩爪的行为时,判断为阳性反应;出现阳性反应后需用相邻低克数的Von Frey细丝进行测量,直至小鼠未出现阳性反应;同一只小鼠两次测量时间间隔至少为5min,记录小鼠出现阳性反应的最低克数值,作为此次测试的机械性缩足阈值。 

热缩足潜伏期(thermal withdrawal latency,TWL)

本实验采用Hargreaves仪器测定小鼠热缩足潜伏期,判断造模后热痛阈。测试时将小鼠放入塑料隔间,适应至少30min,将热源移动到玻璃板下正对小鼠后爪足底,给予红外光刺激,为防止小鼠出现足底烫伤,热源切断时间设置为30s;当小鼠出现抬爪、舔爪、抖爪或缩爪的行为时,判断为阳性反应,并记录时间。每次测试至少重复3轮,每轮测试之间至少间隔5min,每只小鼠取3轮测试的平均值作为此次热缩足潜伏期的缩足时间。

旷场实验(open filed test,OFT)

实验前将小鼠放在行为学实验房间适应至少1h,实验前用75%乙醇擦拭实验箱体(50cm×50cm×50cm,箱体上方开口),测试开始时,将小鼠放入旷场设备的箱体中央,箱体上方配备摄像头,记录小鼠在箱体中的自由活动,活动记录持续5min;使用软件(众实科技)对小鼠的运动总距离(cm)和运动平均速度(cm/s)进行分析。

大小鼠旷场实验系统，型号：XR-XZ301，上海欣软

结果示例：

造模后神经功能缺陷评分：

造模后对小鼠进行Longa神经功能缺陷评分,与Naive组小鼠相比,造模后电凝法[dMCAO组,与线栓法[tMCAO组,两组小鼠均出现神经功能缺陷评分升高,差异有统计学意义。两造模组相比,dMCAO组神经功能缺陷评分低于tMCAO组。  

Fig2 造模后小鼠Longa神经功能缺陷评分

与Naive组小鼠相比,造模后电凝法dMCAO与线栓法tMCAO两组小鼠双侧后爪的热缩足潜伏期均于术后第7天下降,并至少持续到术后第28天;两造模组之间热缩足潜伏期相比差异无统计学意义。提示dMCAO与tMCAO小鼠在造模后出现明显的热痛觉过敏,两造模组术后热痛觉过敏的疼痛程度无显著差异。

Fig3 TWT:热缩足潜伏期;左:小鼠左侧后爪热缩足潜伏期;右:小鼠右侧后爪热缩足潜伏期;

Table1 电凝法与线栓法模型对比