首页
学习
活动
专区
工具
TVP
发布
精选内容/技术社群/优惠产品,尽在小程序
立即前往

科研大会 | 李晓江:利用基因修饰大动物模型研究亨廷顿病

讲者

李晓江

暨南大学粤港澳中枢神经再生研究院教授

广东省非人灵长类动物模型研究重点实验室主任

瑞鸥科学创新联盟成员

由于今天大部分听众是中国学生,所以我会用中文来进行演讲。根据大会的主题,我把我的报告内容调整了一下,因为Huntington's Disease是罕见病,所以我今天着重讲罕见病的研究和治疗。

我们知道亨廷顿病(Huntington's Disease,HD)又叫亨廷顿舞蹈病,该疾病于1916年由Huntington发现,并以他的名字命名。这个疾病最重要的症状是非常明显的舞蹈样动作,舞蹈症状主要是神经细胞的选择性死亡造成的,那么是在哪个部位的神经细胞呢,从图中可以看到大脑纹状体有神经细胞的明显缺失。

实际上,研究HD有几个很重要的发现,第一个是Marian DiFiglia,他们在亨廷顿病死亡病人的脑组织中发现,(亨廷顿蛋白)主要在(神经元的)核里面形成聚集物,这是个很重要的发现。后来我们发现聚集物不仅在核里面,还在神经的轴突里面,说明聚集物实际上分布在很多不同的重要部位。

exon 1 HTT是HD重要的发病机制

我们知道可以用很多方法建立不同的转基因动物模型,在HD的不同转基因小鼠模型中,小鼠可以表达全长的或小片段(的突变基因),结果发现Huntingtin(基因)小片段中最短的一个片段叫exon1,这个基因带一个家传的150Q重复,它的突变造成(大脑中的)聚集物是最多的,模型的表型更严重一些,但随着亨廷顿蛋白的长度增加,甚至到全长的时候,模型的疾病表型逐渐减轻,聚集物也变少了。所以目前认为HTT(huntingtin,亨廷顿蛋白)的exon1是它毒性的主要部位。

后面我们也做了研究,使用敲入HD基因的小鼠模型去做生化研究,比方说分级分离,结果发现全长的HTT主要在胞浆中,只有截短的蛋白,也就是exon1 HTT是在(神经元)胞核内形成聚集物。

所以现在公认全长蛋白的毒性并不是很大,只有当它水解以后变成了小片段的,我们又叫做exon1 HTT的时候,它就会(在神经元内)形成聚集物。异常的HTT与别的蛋白结合后会造成很多毒性作用,这是领域内比较公认的一种学说。

我们前两年的工作又验证了这个学说,我们采用的方法是在HD基因敲入的小鼠模型中,通过CRISPR/Cas9的方法,在HTT的不同的部位进行截短,这样我们就可以产生不同的小鼠模型,分别内源性表达突变HTT不同的截短部位。过去很难去比较不同的小鼠模型,因为表型与生成的表达拷贝数有很大关系,但在这种情况下它全是内源性生成的,就可以去进行比较。结果发现是不管是全长还是截短的形式都产生了exon1 HTT的片段。

我们再看染色的结果,这三种小鼠表达了不同长度的HTT,但都形成同样的HTT的聚集物,而且病变进展的时间是一样的,再比较敲入小鼠模型的表型、行为学表型有无不同。这就说明不管是全长的还是截短的小鼠模型,最终都是由于形成截短蛋白造成聚集物的形成和疾病表型,所以也验证了exon1 HTT是发病机制的重要路径。但是小鼠模型还是有一个缺陷,虽然前面发现了很多重要的现象,比如病理学的变化,但还缺乏神经细胞死亡(的表型)。

我们刚才讲exon1 HTT非常重要,2008年的时候我们发了两篇文章,都是用 exon1去做转基因动物模型,分别是小鼠模型和猴的模型。猴子在出生以后就死了,因为疾病表型非常严重,我们解剖他的脑组织发现很明显的神经变性;但小鼠都不死亡,我们可以看到聚集物生成,但没有神经细胞死亡这个特性。所以基于这个特点,我们当时就想能不能用大动物模型来模拟HD疾病表型。

这里的两篇文章总结了HD的不同小鼠模型,无论是表达全长的或片段的蛋白,还是永久表达或者是敲入的形式,模型中都没有表现出明显的神经细胞死亡的特性。

HTT与互动蛋白的致病机制

我们能看到的表型是什么?是蛋白聚集物形成或一些行为学表型,但缺乏神经变性的表型。我们现在发现在小鼠里面,仅表达突变的HTT不足以引起神经细胞死亡,加上互动蛋白的缺乏就会导致机能障碍。

这是我们在2018年发表的一篇研究Hap1的文章。实际上,Hap1是我们在1995年发现的第一个HTT互动蛋白,如果我们在HTT敲入的小鼠模型中,即表达内源性的全长HTT的情况下,再敲除Hap1。我们可以看到Hap1蛋白的表达减少,神经元蛋白的表达也减少,可以看到(纹状体组织)染色后显示有大片的缺失,即表现了Hap1的丢失造成了神经细胞的丢失,这里的对照组是control gRNA,它不针对任何特异性的基因。那么这是互动蛋白的一个例子。

我们今年又发现了另外一个互动蛋白叫做Hap40,同样,如果用CRISPR/Cas9的方法把Hap40敲低,(通过蛋白印迹实验)可以看到Hap40的蛋白表达减少,我们也可以看到神经元蛋白NeuN的减少。更重要的是看到注射病毒载体的部位,RFP阳性的部位代表病毒载体的表达,染色显示注射部位也缺乏很多神经元蛋白。

所以说明在小鼠模型中单独表达突变HDD还不够,还得抑制它的互动蛋白才会造成神经变性。那么还有一个发现,实际上HDD有很多互动蛋白,但是在灵长类动物里,比如在猴或者人里面,还有一种特异性的作用,比如说跟HDD相结合。我们看到这里蛋白质印迹实验显示有一个蛋白叫做TRIM37,它对蛋白的变性非常重要,它除了结合蛋白还促进蛋白的变性。(与大脑其他部位对比)TRIM37在纹状体的表达非常少,那么我们就怀疑它对纹状体神经变性有比较重要的贡献。

那么我们再去比较。我们使用猴子的样本把HTT和TRIM37蛋白牵出,就发现这两者存在相互作用,而在小鼠中没有。我们又做了一个实验,在猴子组织里面,我们注射突变HTT的同时敲除TRIM37,对照组是不针对任何基因的control gRNA,我们可以发现(对照组中)HTT的表达是比较少的,但(实验组中)如果阻断了或者减少TRIM37蛋白的表达,就会发现HTT更容易形成聚集物。我们刚才知道聚集物是反映HTT蛋白的重要病理变化,这说明HTT互动蛋白对HD的病理变化也是非常重要的。

这就回到上一个问题了,那就是我们刚才谈到小鼠的HD模型单独表达突变HTT不能引起神经细胞死亡的原因,那么这里可以看得很清楚,不同动物种属的大脑结构有很大的区别,特别是小鼠没有特异性的结构—沟回,但是大动物都有这个结构,这也说明实际上种属之间大脑的结构和功能有很大的差别。

利用大动物模型研究HD的优势

所以我们从2010年开始利用大动物模型,建立HD动物模型,首先跟中科院广州健康研究院赖良学教授合作,我们建立了第一个转基因的猪模型,但是转基因猪模型的建模方法是过表达,它只表达截短形式,尤其是表达突变形式,那么它造成的毒性也比较大,小猪刚出生就死了,可以看到它有一些舞蹈症状。

所以后来有领域内的相关学者评论,这个动物模型是过表达,还不能真正反映HD病理发展的真实情况。后面我们又花力气建立了HD敲入的猪模型,这个模型只表达全长的HTT,利用内源性的启动子,所以跟人很接近。最关键的是猪的模型很容易传代,因为猪的性成熟期也就6个月,所以可以传到F1、F2代,我们就可以观察表型的稳定性和一些重要的病理变化。

那么在这里我们很清楚地看到了HD敲入的猪有运动症状,跟病人的运动症状非常相近。这是第一个重要表型,它能够模拟病人明显的病理运动症状。第二个我们最关心有没有神经变性的表型,那么我们去解剖了HD敲入猪,发现它纹状体的体积都比野生型的猪要小很多。

影像检查可以看到一些定量的结果,包括脑室体积增大,侧脑室体积也增大了。最重要的是病理检查,我们用NeuN抗体去反映神经细胞的数量,可以看到纹状体(神经细胞的数量)明显减少,比其他的大脑区域更少。

电镜下还可以明显看到退化的神经元和轴突,这些病理表型在所有HD的小鼠模型中都没有被报道过,只有在猪的模型里面才呈现出电镜层面的充足证据,证明有神经细胞死亡。

我们最近也使用了单细胞测序的方法,我们知道单细胞测序最大的优点是能够聚类细胞,那么通过聚类细胞,我们发现HD敲入猪所丢失的神经细胞类型与病人是非常相近的,我们将HD敲入猪模型的数据与已发表的病人数据和小鼠模型的数据库去进行比较,结果发现两种不同的HD小鼠模型的单细胞测序结果没有神经细胞的丢失,只有在猪的模型里,即HD敲入的猪模型的神经细胞体现了跟病人相似的死亡特性,还有一个很重要的特点是猪和人的大脑细胞的成分结构上有相似性,即胶质细胞的数目是远多于神经细胞的,但小鼠是反过来的,神经细胞的数目多于胶质细胞。

在小鼠和猪模型上

应用基因治疗来治疗HD

所以谈到这里,能不能用基因治疗的方法来治疗HD,为什么要用基因治疗的方法。

首先HD的病理机制非常复杂,这篇综述反映出HTT蛋白一旦产生就几乎可以影响细胞各个方面的功能,所以最有效的方法就是阻断HTT蛋白的表达,让它不产生。这里是之前的实验所得到的结果,包括Dan Cleveland的学者,他们用ASO的方法很好地验证了:在小鼠的模型中阻断HTT的表达后,疾病表型都会随之改善。这些是用ASO的方法,那么能不能直接把HTT的基因去掉呢?

但这存在危险性,为什么?这是两篇最早期的文章,证明敲掉小鼠模型的HTT基因,小鼠是不能存活的,在8天的时候几乎就死亡了。

所以现在领域内有一个很大的挑战:敲掉HTT基因可能带来副作用。所以有学者开发特异性ASO之类的方法,但这个方式是个性化的,想要治疗很多病人的话并不太实用。

所以这是一个很大的挑战,不过我们后面的工作发现HTT是很重要,但它只是对于早期发育重要,在成年阶段敲掉HTT基因并不影响动物的生存和神经细胞(的功能)。

这是我们利用条件性敲除的小鼠模型,在不同的时间段敲除HTT基因,我们发现如果在两个月敲除基因,大部分小鼠会死亡;4个月的时候敲除基因,有部分小鼠死亡;8个月或者是更大的时候敲除基因,只有很少的小鼠死亡。

那么再看生化结果的话,在小鼠成年阶段敲掉HTT并不影响神经细胞(的功能),我们没有看到神经细胞死亡和神经蛋白的丢失。所以当时我们就想HTT的基因是年龄依赖性的,根据这个特点,我们就想能不能全敲掉HTT exon1基因来达到治疗的目的。那么要验证这一点,我们发现有很多文献报道,exon1 HTT是非常重要的,比如说它有17个氨基酸几乎在所有的种属里面都是非常保守的,而且这17个氨基酸也被报道跟HTT在亚细胞的分布很有关系,但是我们用小鼠模型证明,实际上是可以敲掉整个exon1 HTT。

我们建了一个小鼠模型,它是在阅读框内敲除exon1,那么蛋白只没有了exon1的部分,但其他的结构域都表达。与野生型的小鼠相比,这个小鼠模型HTT的表达减少,但是我们看不到有任何神经细胞的死亡,包括在基因表达谱和免疫荧光染色都没看到,而且小鼠生下来的时候没有问题。

所以说实际上去掉exon1对动物的生存和神经细胞影响不大。

另外一个最重要的实验是在2017年,我们第一次在HD敲入小鼠中用CRISPR/Cas9敲掉exon1,这是注射(病毒载体)以后,我们可以看到这个病毒在纹状体里面很好地表达。

最关键就是在这个注射的部位,我们可以看到这里的聚集物几乎都消失了,而邻近部位的聚集物还存在,这是非常令人惊喜的,为什么?

因为这些小鼠实际上已经形成了很多聚集物,当你阻断HTT的表达以后,它没有再持续表达,说明聚集物可以被神经细胞清除掉,还能恢复功能。那么同时比较小鼠的行为学表型,敲掉exon1 HTT以后,HD敲入小鼠的运动症状和行为也得到了改善。

最近我们也用同样的方法对HTT敲入的猪进行了相同的治疗方法,那么治疗方法也是用CRISPR/Cas9去掉exon1 HTT。

这里有两种方法,一种是在HTT敲入猪的成年猪脑里直接注射AAV病毒载体,来敲除HTT,还有一种是对新生的猪进行静脉注射,因为这个时候血脑屏障还没有完全形成,所以血液里的病毒能进入到大脑组织来达到基因修饰的目的。

如果通过脑注射的方法,我们可以发现注射脑区内比如纹状体中病毒的表达很多,这些都表示纹状体有很多神经细胞被感染了,能够被打靶。这里第一个关键的数据证明,和野生型相比,control-gRNA组有明显的突变HTT的表达,有神经细胞蛋白的减少和胶质细胞蛋白的增加;但是如果敲低了HTT,神经细胞蛋白的表达增加,胶质细胞蛋白的水平减少。这是行为学的验证,可以看到动物的步伐也得到了改善。那么这些证明脑注射的方法能够有效的减少突变HTT,达到治疗的目的。

这个是静脉注射的方法,静脉注射方法是全身性的,全身(组织)的蛋白质印迹实验可以看到,HTT蛋白的表达都减少,这里面有两个被治疗的、两个未治疗的,还有两个野生型的,都可以看到HTT是减少的。那么行为学层面的治疗效果怎么样?这个是未经过治疗的HD敲入的猪,这是经过治疗的HD敲入的猪,可以看到它运动步伐明显的得到了改善。

基因治疗HD

在非人灵长类动物中的研究进展

那么最近我们做了实验想证明这种治疗方法的安全性。比如说我们在非人灵长类动物,我们敲掉HTT能不能达到治疗目的和保障安全性。这是我们初步的结果,这个实验里我们对成年的猴脑通过AAV CRISPR/Cas9去敲除HTT exon1,因为我们知道exon1是一个非常重要的致病部位。检测DNA可以看到经过注射以后有明显的DNA打靶的现象,关键是在染色的部位,我们可以看到凡是表达了AAV病毒载体的,HTT的表达量明显减少,说明这种方法能够非常有效的减少HTT的蛋白表达。

那么最关键的就是在HTT表达减少的神经细胞里面,NeuN的表达与对照组是一样的,并没有出现明显的变化。这里是放大的效果,可以看到箭头所指的地方表达了AAV病毒载体,就是能够敲除HTT基因,在这里几乎不表达HTT的蛋白,但是它的神经细胞形态和NeuN的表达还是存在的。这也证明了在成年动物里敲掉HTT的基因,实际上对神经细胞的影响不是很大。

那么这里就得出了几个结论。第一,研究HTT,结合不同的动物模型,我们发现exon1是导致HD的最重要的部分。第二,HTT的功能也很重要,但这个功能是年龄依赖性的,它对早期的神经发育很重要。但是在成年阶段敲掉的话,对神经细胞的生成就没有那么重要了。第三,我们提出假设,可以直接在成年HD的病人脑组织里敲掉HTT基因。这种方法比较简单,不需要设计特异性ASO而且还更加有效。所以我们最近致力于研究这种方法的安全性,测试能否在临床上用这种方法来治疗HD。

这是我在暨南大学的团队,他们对不同的动物模型研究作出了重要的贡献,我就讲到这里,谢谢大家。

  • 发表于:
  • 原文链接https://page.om.qq.com/page/OMiIDU_oyRRh2bvvcTAll_6A0
  • 腾讯「腾讯云开发者社区」是腾讯内容开放平台帐号(企鹅号)传播渠道之一,根据《腾讯内容开放平台服务协议》转载发布内容。
  • 如有侵权,请联系 cloudcommunity@tencent.com 删除。

相关快讯

扫码

添加站长 进交流群

领取专属 10元无门槛券

私享最新 技术干货

扫码加入开发者社群
领券