技术介绍 | 表观基因组学产品：CUT&Tag技术解析（上篇）

一、技术背景

在表观遗传学研究领域，染色质免疫共沉淀测序（ChIP-seq）曾长期作为金标准技术。然而其固有的技术缺陷日益凸显：需要百万级细胞起始量、甲醛交联导致的表位遮蔽、高背景噪音等问题严重制约了微量样本和单细胞研究。2019年，Fred Hutchinson癌症研究中心的Steven Henikoff团队在《Nature Communications》发表的CUT&Tag技术，标志着表观组学检测进入"超微量、高精度"新时代。

二、技术原理与核心组件

2.1 分子机制解析

CUT&Tag（Cleavage Under Targets and Tagmentation）的核心创新在于将抗体介导的靶向识别与Tn5转座酶的DNA剪切-标签化功能有机结合。其工作流程可分为四个关键阶段：

1，原位抗体锚定：透化处理的细胞核内，一抗特异性结合目标蛋白（如H3K4me3组蛋白修饰）

2，级联放大系统：二抗桥接Protein A/G-Tn5融合蛋白，形成靶向复合物

3，精准DNA剪切：Mg²⁺激活Tn5转座酶，在抗体结合位点附近实现DNA双链切割

4，标签化建库：预载测序接头的Tn5直接完成片段末端标记，极大简化建库流程

CUT&Tag技术相比ChIP-seq和CUT&RUN具有显著优势：其采用Protein A-Tn5转座酶复合物，在活细胞中原位完成DNA切割和测序接头连接，避免了ChIP-seq的交联和超声破碎步骤，大幅简化了操作流程并减少了背景噪音。同时，CUT&Tag通过Mg²⁺浓度梯度控制，实现了靶向切割，提高了实验特异性和效率，尤其适用于微量样本和复合位点解析。整体实验周期更短（仅需1天），数据量需求更低（仅需5M reads），显著提升了实验的便捷性和准确性。

对比K562细胞的H3K4me1数据集显示：

2.2 核心组件突破

该技术的革命性突破源于两大分子工程创新：

1，PAG-Tn5融合蛋白：将金黄色葡萄球菌Protein A/G与超活性Tn5转座酶融合，兼具抗体结合与DNA剪切双重功能。最新研究显示，经密码子优化后的Tn5变体（如E54K/L372P）可使标签化效率提升3倍（Nature Protocols, 2020）

2，双功能接头系统：转座酶预载的Illumina兼容接头包含分子条形码（UMI），不仅实现单步建库，还能有效校正PCR重复偏差。

注：图中绿色表示抗体、灰色椭圆表示核小体、蓝色表示靶向蛋白、灰色方框表示pA-Tn 5转座体

三、实验流程优化

3.1 标准化操作流程

基于《Nature Protocols》的优化方案，当前标准流程可在8小时内完成：

1，细胞处理（30min）：采用0.05% Digitonin透膜，保持染色质天然构象

抗体孵育（2h）：推荐使用ChIP验证过的兔源单抗（如CST公司的H3K27me3抗体）,

2，Tn5标签化（1h）：关键参数为300mM NaCl洗涤条件，可去除97%非特异性结合（bioRxiv, 2021）,

3，文库扩增（15 cycles）：采用KAPA HiFi HotStart酶保证低偏倚扩增

3.2 关键参数控制

1，细胞起始量：常规实验仅需50,000个细胞，单细胞方案可低至单个细胞（Nature Methods, 2023）

2，测序深度：建议H3K4me3等窄峰修饰采用20M reads（6Gb数据），H3K27me3等广域修饰需40M reads

3，对照设计：必须包含IgG同型对照和Input对照，推荐使用SPIKE-IN（如pAG-MNase）

参考文献

1，Kaya-Okur, Hatice S., et al. "CUT&Tag for Efficient Epigenomic Profiling of Small Samples and Single Cells."Nature Protocols, vol. 15, no. 3, 2020, pp. 3264-3283, doi:10.1038/s41596-020-0373-x.

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