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STTT重磅 | 周平坤团队揭秘巴豆酰化介导的DNA损伤修复新机制

景杰生物 | 报道

恶性肿瘤的化疗和放疗抵抗极大地阻碍了癌症治疗效果,增加了患者死亡率。DNA双链断裂(DSB)是最严重的DNA损伤形式,其修复对于维持基因组完整性和遗传信息准确性至关重要。在放疗中,DSB是主要的分子基础。Ku80是DNA-PK复合物的关键组成部分,在DSB修复中发挥核心作用。然而,DNA-PK的组装和激活机制尚未完全明确。

2011年被芝加哥大学赵英明教授研究团队首次报道了巴豆酰化修饰(Crotonylation,Kcr),其相关研究荣膺Cell 2011年度五大研究亮点之一。巴豆酰化修饰广泛存在于组蛋白和非组蛋白中,并参与多种生物过程的调控。近年来,研究发现巴豆酰化修饰在DNA损伤应答(DDR)中发挥重要作用,但其在DNA双链断裂修复中的具体机制尚不清楚。

4月21日,北京放射医学研究所周平坤、关华团队,联合中南大学湘雅公共卫生学院黄瑞雪团队在Signal Transduction and Targeted Therapy(IF=40.8)发表了题为“Conversion of Ku80 K568 crotonylation to SUMOylation facilitates DNA non-homologous end joining and cancer radioresistance”的最新科研成果。该研究运用巴豆酰化修饰组学技术,揭示了辐射诱导的DNA损伤后Ku80 K568位点的巴豆酰化修饰到SUMO化修饰的转换对DNA-PK复合体组装和激活的影响机制。

该研究首先通过对有或没有γ射线照射的MCF-7细胞进行巴豆酰化修饰组学分析,共鉴定出3844个蛋白上的20910个巴豆酰化修饰位点,发现Ku80 K568位点的巴豆酰化修饰在辐射诱导的DNA损伤后下降,并鉴定出PCAF和HDAC8分别为该位点的巴豆酰基转移酶和去巴豆酰化酶,此外,还揭示了CBX4介导的SUMO化修饰在DNA损伤后对Ku80 K568cr的调控作用,为克服肿瘤放化疗耐受提供了新的潜在靶点。景杰生物为该研究提供了巴豆酰化修饰组学技术、巴豆酰化/乙酰化修饰抗体、定制抗体服务支持。

01

DNA损伤后巴豆酰化修饰动态变化

为明确赖氨酸巴豆酰化参与细胞对红外诱导的DNA损伤的作用,研究者对有无γ射线照射的MCF-7细胞进行了定量巴豆酰化修饰组学分析,结果共鉴定出3844个蛋白上的20910个巴豆酰化修饰位点。发现辐射后细胞内多种与DNA双链断裂修复相关的蛋白质巴豆酰化水平发生变化,其中Ku80 K338和K568位点在辐射后巴豆酰化水平显著降低。

实验数据显示,遭受辐射后,Ku80的总巴豆酰化水平在1小时内开始下降,表明细胞对DNA损伤快速响应。通过体外构建Ku80 K338R/K568R突变体,研究发现相较于K338R突变后不影响Ku80的巴豆酰化修饰水平,Ku80 K568突变后的巴豆酰化修饰水平显著降低而不影响其乙酰化修饰水平,证实了Ku80 K568是关键的巴豆酰化修饰位点。利用景杰生物提供的位点特异性巴豆酰化抗体进一步验证发现γ射线辐照HeLa细胞裂解物中Ku80 K568cr减少,再次证实了上述结论。

图 1 定量巴豆酰化修饰分析鉴定辐照下赖氨酸巴豆酰化修饰变化

02

HDAC8和PCAF是Ku80 K568的巴豆酰化修饰调控酶

鉴于多个乙酰化酶和脱乙酰化酶可同时调控巴豆酰化和乙酰化修饰,因此,研究接下来确定HDACs和SIRTs中具体有哪些成员可调控Ku80的巴豆酰化修饰。

研究分别使用HDAC抑制剂曲古抑菌素A(TSA)和SIRT抑制剂烟酰胺(NAM)处理细胞,发现只有TSA能增加Ku80巴豆酰化水平,并且只有HDAC8能显著降低Ku80巴豆酰化水平,其表达量与Ku80巴豆酰化水平呈负相关。这提示HDAC8可作为Ku80的去巴豆酰化酶。

此外,为进一步鉴定Ku80 Kcr的巴豆酰化酶,研究在HEK-293T细胞中过表达乙酰转移酶,结果发现PCAF能促进Ku80巴豆酰化,其表达量与Ku80巴豆酰化水平呈正相关。进一步的体外实验也证实了PCAF对Ku80的巴豆酰化作用以及HDAC8对Ku80的去巴豆酰化作用。以上结果表明Ku80的巴豆酰化修饰由PCAF和HDAC8共同调控。有意思的是,研究还发现辐射照射会加剧Ku80与HDAC8之间的相互作用,而不会改变Ku80与PCAF之间的相互作用,这便解释了Ku80巴豆酰化修饰的降低可能由于IR诱导的Ku80和HDAC8相互作用加强了Ku80的去巴豆酰化。

图 2 HDAC8和PCAF共同调控Ku80 K568的巴豆酰化

03

Ku80 K568R增强其与DNA-PKcs的相互作用并抑制后者自磷酸化

为了进一步确定Ku80 K568巴豆酰化修饰对其响应DNA损伤的内在机制,研究对携带外源野生型Ku80 (WT)的Ku80敲低和突变型(Ku80 K568R)的HeLa稳定细胞系中进行了激光微照射实验。结果显示,K568突变后不会影响Ku80向DNA损伤位点的募集,且K568R突变体与DNA-PKcs的结合能力增强。这可能改变了DNA-PKcs的构象,从而影响其活性。这种结合力的增强可能干扰了DNA-PK复合体的正常组装和功能发挥。

此外,S2056位点的自磷酸化是DNA-PKcs激活的关键步骤,对于启动DNA损伤修复至关重要。该研究证实K568R突变导致DNA-PKcs S2056位点的自磷酸化水平降低,从而调控DNA-PKcs激活。以上结果说明K568位点的巴豆酰化影响Ku80与DNA-PKcs的相互作用,并减弱DNA-PKcs S2056的自磷酸化,在DSB修复中的功能调控具有潜在的作用。

图 3 Ku80 K568与K568R调控Ku80与DNA-PKcs的相互作用

04

Ku80 K568的去巴豆酰化修饰增强SUMO化修饰

先前研究报道Ku80可发生SUMO化修饰,因此研究进一步分析了Ku80的SUMO化修饰和在同一赖氨酸残基上Ku80的巴豆酰化修饰的串扰。研究发现,DNA损伤后,Ku80 K568位点的巴豆酰化水平下降,同时SUMO化水平上升。当使用HDAC8特异性抑制剂PCI-34051时,Ku80 K568位点的巴豆酰化水平上升,而SUMO化水平下降,这些结果表明巴豆酰化和SUMO化在该位点上存在相互影响。

进一步研究表明,CBX4是介导Ku80 SUMO化的关键E3连接酶,能够显著促进Ku80的SUMO化修饰,并与Ku80存在相互作用。敲低CBX4后,细胞中Ku80的SUMO化水平显著降低。同时,PCI-34051消除了DNA损伤诱导的Ku80 K568cr下调,而导致Ku80 SUMO化受阻,这说明去巴豆酰化修饰是SUMO化的前提条件。这一发现揭示了Ku80 K568位点的修饰转换机制,即DNA损伤后,HDAC8介导的去巴豆酰化修饰为CBX4介导的SUMO化提供了条件,从而促进了DNA-PKcs激活和DNA损伤修复。

图 4 Ku80 K568位点的巴豆酰化与SUMO化修饰间的Crosstalk

05

Ku80 K568R突变导致DNA双链断裂修复缺陷并增强肿瘤细胞对放化疗的敏感性

最后,研究探究了Ku80 K568对肿瘤放疗敏感性的作用。实验显示,Ku80 K568R突变导致DNA DSB修复缺陷,使细胞对辐射更敏感,具体表现为γ-H2AX焦点残留增加、凋亡比例上升、细胞生长和集落形成能力下降,且对多种DNA损伤剂的敏感性增加。此外,在裸鼠移植瘤模型中,Ku80 K568R突变肿瘤的生长速度减慢,且对放化疗更加敏感。以上结果提示Ku80 K568是其在启动DNA DSB修复和确定癌症对化疗/放疗敏感性方面功能的关键位点。

值得注意的是,在多种癌症细胞系(如A549、HepG2和U87)中,Ku80 K568R降低了DNA损伤修复效率,增加了DNA双链断裂的残留。同时,Ku80 K568R使肿瘤细胞对放疗更敏感,抑制了肿瘤生长。此外,HDAC8抑制剂PCI-34051能阻断辐射诱导的Ku80 K568位点去巴豆酰化和SUMO化的变化。以上结果表明Ku80 K568的巴豆酰化与SUMO化修饰的Crosstalk机制在多种癌症中具有共性,为克服肿瘤放疗耐受提供了潜在靶点。

图 5  Ku80的K568R突变使癌细胞对DNA损伤剂敏感并抑制癌症的发展

综上所述,研究基于巴豆酰化修饰组学和巴豆酰化/乙酰化修饰抗体、Ku80 K568定制抗体验证等方法对非同源末端修饰和肿瘤放疗的内在机制进行深入探究:在电离辐射下,HDAC8介导Ku80 K568的去巴豆酰化修饰,并增强CBX4介导的同一位点的SUMO化修饰,促进DNA-PKcs自磷酸化修饰,增强DNA-PK复合体的组装和激活,提高NHEJ修复途径的活性,使肿瘤细胞对放疗敏感性显著提高。值得注意的是,研究证明该机制在多种肿瘤细胞中具有共性,为克服肿瘤放化疗耐受提供了新的潜在靶点。

景杰评述

本文通过巴豆酰化修饰组学、抗体验证等系列组合拳的研究思路,首次指出了Ku80 K568位点巴豆酰化修饰与SUMO化修饰的Crosstalk,揭示了Ku80 K568cr调控DNA-PK复合体的组装和激活,提高NHEJ修复途径的活性的内在机制。此外,研究还证明该机制在多种肿瘤细胞中具有共性,为克服肿瘤放化疗耐受提供了新的潜在靶点,为理解Ku80的功能调控提供了新的视角,还为研究其他蛋白质的修饰状态和功能调控提供了重要的借鉴,特别是在揭示修饰之间的动态平衡及其对蛋白质功能的影响方面。

景杰生物作为新型酰化研究的领跑者,在上万例样品中积累了丰富的新型酰化修饰研究经验和实验方案。可提供“从WB预筛选,新型酰化修饰组学分析,到运用丰富的酰化修饰位点特异性抗体进行功能验证,再到后续的CUT&Tag分析”等全流程服务。景杰生物PTMab抗体产品具有高特异性、高亲和力、高批间一致性等优势,其应用也多次见刊于Cell、 Nature、 Science等国际顶尖杂志。如果您想了解景杰生物研究产品和服务的更多信息,可咨询景杰生物销售工程师、或拨打科服热线400-100-1145。

参考文献:

Hongling Zhao. et al. 2025. Conversion of Ku80 K568 crotonylation to SUMOylation facilitates DNA non-homologous end joining and cancer radioresistance.Signal Transduct Target Ther.

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  • 原文链接https://page.om.qq.com/page/OdqIcGIQITM-wW0zXdt8Kl1g0
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