针对蛋白复合体中蛋白磷酸化灵敏的伪靶向质谱方法分析

传统靶向蛋白组学研究多采用鸟枪法,基于DDA(Data Dependent Acquisition)数据采集模式,最大化鉴定蛋白数量,但对于低丰度的多肽,往往难以获得理想的二级质谱信息。相较于DDA采集模式,平行反应监测PRM(Parallel Reaction Monitoring)采集模式可以获取列表中母离子的全部碎片信息,具有高灵敏度、重现性好、准确定量等特性。与传统MRM方法相比,基于Quadrupole-Orbitrap等仪器的PRM模式具有更好的分辨率和选择性。该研究中,作者建立了灵敏的伪靶向质谱分析方法,用于蛋白复合体中磷酸化肽及磷酸化位点的分析。

该方法主要分为两部分:第一部分采用传统的DDA采集模式,进行质谱信息获取和蛋白鉴定,发现其中的磷酸肽并进行评分。评分≥30的多肽被认为是高置信度磷酸化肽,无需进行下一步处理。而其中评分m/z、电荷数构建数据库。第二部分则根据构建的数据库进行PRM扫描,选择、捕获并获取数据库中相应的母离子的MS/MS信息。通过MS/MS信息的完善,将在DDA中鉴定到的低置信度多肽转化为高置信度多肽,方法的工作流程见图1。

图1 方法的工作流程

作者将该方法应用于经表皮生长因子(EGF)刺激后,Shc1蛋白成分及磷酸化位点的研究。以表达Flag-Shc1的特殊HeLa细胞作为实验样本,野生HeLa细胞作为对照。采用抗Flag抗体进行免疫沉淀提取Sch1相关蛋白,然后进行胰蛋白酶酶切获得多肽片段。首先应用传统DDA方法,结合MASCOT数据库,共鉴定了29种蛋白组分。除此之外,额外加入其他7种有文献报道与EGF-Sch1复合体相关的蛋白作为研究对象。其中33种蛋白给药(EGF 100 ng/mL)2min后含量至少上调50%,加上Sch1自身共34种蛋白被认为是Sch1蛋白复合体的潜在组分。其次应用MaxQuant软件,基于DDA模式中鉴定出的蛋白,设置Ser/Thr/Tyr作为磷酸化位点,共鉴定94种磷酸化肽,其中42个磷酸化位点的分数≥30,认为是高置信度磷酸化肽。

图2 同一肽段在DDA模式下(A)和PRM模式 (B)下的MS/MS信息

接下来进行PRM模式的数据采集。如图2所示,PRM模式可以完善蛋白的MS/MS信息,并显著提高DDA模式中低置信度磷酸肽的拟合分数。采用PRM模式共发现了Sch1蛋白中的37种磷酸化肽,包括了34个不同的磷酸化位点。其中19个与之前DDA模式鉴定的位点重合,15个是采用PRM新鉴定出的磷酸化位点。采用PRM模式将该方法的磷酸化位点总鉴定数提高到了57个。

表1不同时间点EGF给药后Sch1蛋白磷酸化位点数目变化

将基于PRM模式的伪靶向质谱分析方法应用于不同时间给药后的磷酸化位点数量变化研究中。如表1所示,采用PRM模式后,该方法鉴定到的磷酸化位点数量显著提升,随着给药时间的延长,Sch1蛋白的磷酸化位点数量增多,该方法共鉴定到82个Sch1蛋白的磷酸化位点,其中96%在PhosphoSitePlus翻译后修饰数据库中检索到DDA模式中鉴定出的34种蛋白的相应磷酸化位点进行了归属。

图3不同时间点EGF给药后Sch1蛋白磷酸肽及磷酸化位点的动态变化

基于PRM方法的准确定量特性,应用该方法研究给药EGF后Sch1蛋白复合体的动态变化。图3中方框部分代表不同的蛋白种类,橙色圆圈代表磷酸化位点及数目。给药后,共有33种蛋白含量上调(橙色),部分蛋白含量下调(白色),蓝色方框则代表与Sch1形成复合体的蛋白。进一步分析磷酸化位点随给药时间的变化,磷酸化位点总数在给药20min后达峰,42.7%的磷酸化位点在给药2、5、20min后样品中均存在,认为这些磷酸化位点在给药后迅速激活并发生作用。

图4 不同时间点EGF给药后EGFR蛋白磷酸肽含量变化

(A:基于质谱响应的各磷酸肽含量变化;B:经过EGFR蛋白归一化后的各磷酸肽含量变化)

以EGF-Sch1蛋白复合体中代表性组分EGFR的Y1172和Y1197磷酸化位点举例分析方法的定量特性。如图4A所示,基于质谱响应进行各磷酸化肽含量研究,Y1172和Y1197两个磷酸化肽含量在给药后5min达峰,与文献中报道相符;如图4B所示,将各磷酸肽的质谱响应经EGFR蛋白的质谱响应归一化处理后,Y1172和Y1197两个磷酸化位点的占有量在2min达峰,5min下调,20min上调。作者认为,Y1172和Y1197两个磷酸化位点的动态变化体现了Sch1经诱导后磷酸化作用的迅速激活,该方法可以作为研究蛋白复合体动态变化的有力手段。

综上,作者建立了伪靶向质谱分析方法研究了蛋白样品中的低丰度磷酸化肽,采用DDA和PRM两种采集模式,以DDA模式中的得到的低置信度磷酸化肽建立数据库,在PRM模式中将这些磷酸化肽进行确证,并将该方法应用于EGF-Sch1蛋白复合体中低丰度磷酸化肽的研究中。除了磷酸化肽之外,作者认为该方法还可能应用于其他低丰度多肽样本的痕量分析。

参考文献

LyuJ, Wang Y, Mao J, et al. Pseudotargeted MS Method for the Sensitive Analysis of Protein Phosphorylation in Protein Complexes[J].Analytical Chemistry, 2018

文献整理人:唐煜;编辑:生宁 张金兰;第94期

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