Sci Adv新方法！赵英明/王初团队合作开发组蛋白修饰数据库搜索新策略

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景杰生物 | 报道

组蛋白修饰（histone marks）在染色质结构和功能中起着关键作用。组蛋白修饰的异常调节可导致生理变化和疾病发生，如癌症和神经系统疾病。研究组蛋白修饰功能的第一步是确定哪些残基发生翻译后修饰，以及组蛋白修饰的变化如何与生物学结果相关。因此，用于识别和量化组蛋白修饰的抗体以及分析工具对表观遗传学研究至关重要。

2023年4月5日，芝加哥大学赵英明团队与北京大学化学与分子工程学院王初团队在权威期刊Science Advances上合作发表了题为“Identification of 113 new histone marks by CHiMA, a tailored database search strategy”的最新研究论文[1]。该研究开发了一种采用“50%匹配碎片离子”作为标准，以进行高置信度搜库的新策略，命名为“全面组蛋白修饰分析(Comprehensive Histone Mark Analysis, CHiMA)”。通过CHiMA对研究者之前的蛋白质组学数据进行重新分析，识别到的组蛋白修饰位点几乎是传统方法的两倍，其中113个为新发现的组蛋白修饰位点，包括赖氨酸乳酸化(Kla)、巴豆酰化(Kcr)、2-羟基异丁酰化(Khib)和苯甲酰化(Kbz)四种修饰类型。该工具不仅为识别组蛋白修饰提供了有价值的方法，而且极大地扩展了组蛋白修饰的数据库。

目前，基于质谱的鸟枪蛋白质组学（shotgun proteomics）是识别和量化组蛋白修饰的首选方法。在鸟枪蛋白质组学中，传统的数据库搜索方法依赖于“目标-诱饵”策略来计算假发现率(false discovery rate, FDR)，以区分真假肽段谱图，但该策略由于组蛋白修饰数据量小而导致FDR不准确。为探究这一问题，研究者测试了 4个组蛋白Kla数据集，通过使用ProLuCID、Andromeda两种算法进行分析，表明该策略对组蛋白修饰的识别很可能是随机的。此外，该策略无法识别小数据集中的一些修饰肽段，即使这些肽段能产生高质量的MS/MS谱图。

图1传统的数据库搜索策略和CHiMA的工作原理图

已有文献证明，在分析非常小的数据集时，手动检查谱图真肽谱匹配(peptide spectrum matches, PSMs)有助于验证肽段的真实性。因此，作者提出以“碎片离子覆盖度 (fragment ion coverage, FIC)”作为关键标准的搜库策略。结果表明，与基于FDR的策略相比，基于FIC的策略在敏感性和全面性方面有所改善。例如，在假阳性率仅为2%的情况下，使用“50%的FIC cutoff”可以筛选出所有的真阳性，而基于1%的FDR只能获得75%的真阳性率。因此，使用50%的FIC cutoff来过滤四个数据集中的PSM，不仅保留了之前鉴定的Kla肽段，而且还鉴定到了所有丢失的Kla肽段。

图2 利用FIC优化过滤策略，提高识别的全面性

组蛋白上经常发生不同PTMs之间的串扰（crosstalk），研究进一步发现，将一些常见的精氨酸和赖氨酸修饰作为共存PTMs整合搜库时，通过识别肽段内共存修饰可增强组蛋白修饰肽段鉴定 。作者首先使用基于FIC的策略过滤PSM重新分析了数据集A和E，发现六种最常见的组蛋白修饰(Kac、Kme1和Rme1、Kme2和Rme2、Kme3)中，Kac、Kme1和Rme1是与Kla共存的最常见的修饰。将这三种最常见的共存修饰整合到数据库搜索中，可以显著提高Kla的识别率（当包括Kac时，数据集A和E中识别出的Kla位点数量分别从11个和20个增加到15个和31个。而当Kac、Kme1和Rme1都被包括在内时，在这两个数据库中分别识别出16个和35个Kla位点，分别增加了45%和75%）。

图3 优化数据库搜索参数以识别单肽内共存组蛋白修饰

最后，作者使用改进的CHiMA策略分析了团队之前的蛋白质组学数据集（包括4个乳酸化（Kla）数据集，14个巴豆酰化（Kcr）数据集，4个苯甲酰化（Kbz）数据集和12个2-羟基异丁酰化（Khib）数据集）。CHiMA在经典组蛋白和组蛋白变体上共发现了113个先前未报道的组蛋白修饰（包括26个额外的新Kla位点，44个额外的Kcr位点(24个在经典组蛋白上，20个在变体上)，25个额外的Khib位点(7个在经典组蛋白上，18个在变体上)，9个额外的Kbz位点(5个在经典组蛋白上，4个在变体上)），在原组蛋白修饰位点基础上扩展了几乎一倍的水平。

图4 CHiMA策略在先前分析的MS/MS数据集中鉴定到新的113个组蛋白修饰

总而言之，该研究开发了一种采用“50%匹配碎片离子”作为标准来识别高置信度PSM的搜索新策略-ChiMA，将CHiMA应用于之前的MS/MS数据集，识别了113个未报道的组蛋白修饰位点，从而将组蛋白库扩展了几乎一倍。这113个新修饰位点的鉴定也为生理背景下组蛋白的酰化修饰研究打开了新的窗口。此外，当涉及小型MS/MS数据集时，该方法也可以直接应用于非组蛋白的分析。因此，CHiMA为组蛋白和非组蛋白修饰的研究提供了一个有价值的工具。

图5 更新后的经典组蛋白Kla、Kbz、Kcr和Khib图谱

在新型酰化修饰抗体以及新型酰化修饰组学检测领域，景杰生物作为该领域的领跑者，致力于生物学领域的多项研究。就组蛋白研究而言，景杰能够以更高的深度和覆盖度完成组蛋白修饰位点的检测，以乳酸化修饰为例，目前已助力发表多篇组蛋白乳酸化修饰相关的研究：如中科院广州生物医药与健康研究院刘兴国团队于2020年7月在Nature Metabolism上报道的乳酸化修饰介导细胞命运的“表观组-代谢组-表观组”跨界调控；上海交通大学医学院附属第九人民医院贾仁兵团队于2021年3月在Genome Biology上报道的蛋白质乳酸化修饰调控肿瘤增殖的最新分子机制；浙大医学院王青青/来利华/丁克峰团队于2022年3月在Molecular Cell上报道的乳酸化调控RNA m⁶A修饰促进肿瘤的免疫抑制等。