单细胞转录组分析揭示自身免疫病中的异常基因表达模式和细胞状态

今天介绍的是一篇纯生信分析的单细胞数据挖掘的文献，分析方法是单细胞分析中比较常规的方法（单细胞图谱，细胞通讯），不过有疾病之间的差异比较。

概述

基本信息

文章标题：Single-cell transcriptional profling reveals aberrant gene expression patterns and cell states in autoimmune diseases 发表时间：2024-01 发表杂志：Molecular Immunology 影响因子：4.174

文章摘要

背景：多发性硬化症 （MS）、原发性干燥综合征 （pSS） 和系统性红斑狼疮 （SLE） 具有许多一致的临床症状和血清学特征，他们都属于自身免疫性疾病。

方法：文中分析了 17 例患者（5 例 MS、5 例 pSS 和 7 例 SLE）和 10 例健康对照（HC）的 153,550 个细胞的 scRNA-seq 数据，并检查了外周血单核细胞 （PBMC） 中生物过程富集、差异表达基因 （DEG）、免疫细胞类型及其亚群以及细胞间通讯的情况。

结果：B细胞、巨核细胞、单核细胞和增殖性T细胞的百分比在自身免疫性疾病中呈现出显著变化。基于基因表达的细胞类型的富集显示单核细胞升高。MIF、MK和GALECTIN信号网络在自身免疫性疾病中存在明显差异。综上所述，文中的分析提供了单细胞水平上自身免疫性疾病患者的细胞类型和状态的综合图谱，以更好地理解这些自身免疫性疾病的发病机制和治疗。

研究背景及实验设计

研究背景

自身免疫性疾病 （AD） 具有多因素病因：遗传、环境、激素和免疫学等。多发性硬化症 （MS）、系统性红斑狼疮 （SLE） 和原发性干燥综合征 （pSS） 是优先影响特定靶器官的复杂 AD。

多发性硬化症（MS）是一种典型的慢性炎症。实际上，有证据表明 T 细胞和 B 细胞都参与 MS。然而，目前尚不清楚每种细胞类型对疾病发病机制的贡献程度。

系统性红斑狼疮（SLE）也是一种慢性炎症性的自身免疫性疾病。这种疾病会损害各种器官，包括肾脏，通常预示着疾病的不良病程。系统性红斑狼疮的发生受种族、遗传易感性和环境危险因素的显著影响。在SLE易感患者中引起异常免疫反应的最常见环境因素是病原体。

口干和眼睛干涩是原发性干燥综合征 （pSS） 的症状，这是一种复杂的自身免疫性疾病，其特征是唾液腺和泪腺的局部淋巴细胞浸润。

事实上，这些AD主要与B细胞或T细胞缺乏耐受性有关。人类白细胞抗原 （HLA） 位点通常与 AD 易感性风险增加直接相关。尽管详细的分子、免疫学、遗传学和临床研究已经深入了解了诱导某些 AD 的分子机制，研究人员尚未完全了解人类 AD 的驱动因素，例如环境因素和发病机制。

scRNA-seq技术提供了对细胞异质性，关键亚群和状态以及分化轨迹的见解。因此，scRNA-seq的发展为进一步揭示以前未被识别的疾病相关细胞群或功能状态及其标记物和潜在的分子调节因子提供了可能性。

样本

本文使用了7例SLE患者、5例MS患者、5例pSS患者和10例健康对照（HC）的PBMCs的scRNAseq数据，来源于三个GEO数据集：GSE157278，GSE135779，GSE138266。

下载链接分别为：

• https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE157278
• https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE135779
• https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE138266

具体信息如下：

• 7例SLE患者：GSM4029943, GSM4029944, GSM4029945, GSM4029946, GSM4029950, GSM4029951, GSM4029952（来源于GSE135779数据集）
• 5例MS患者：GSM4104134, GSM4104135, GSM4104136, GSM4104137, GSM4104138（来源于GSE138266数据集）
• 5例pSS患者：GSM4760625, GSM4760626, GSM4760627, GSM4760628, GSM4760629（来源于GSE157278数据集）
• 10例健康对照（HC）：GSM4029940, GSM4029941, GSM4029947, GSM4029948, GSM4029949, GSM4760620, GSM4760621, GSM4760622, GSM4760623, GSM4760624（来源于GSE135779和GSE157278数据集）

研究结果

PBMC的单细胞图谱和聚类

通过质量控制和筛选，从7例SLE患者(34,596)、5例MS患者(25,349)、5例pSS患者(25,361)和10例健康对照HC(68,244)的样本中构建了包含153,550个细胞的图谱并通过聚类分析鉴定出15种不同的细胞类型（图1A-B）。

作者用于注释细胞类型的marker基因列表总结如下：

• B cells： CD79A, CD74, HLA-DRA, HLA-DQB1, MS4A1
• CD8+ T cells： CD8B, NELL2, CD8A, NOSIP, and CCR7
• early progenitor cells： SOX4, EGFL7, STMN1, HMGA1, CDK6
• macrophages： IFITM3, LST1, SERPINA1, AIF1, and PSAP
• megakaryocytes：PPBP, PF4, TUBB1, GP9, and GNG11
• Memory CD4+ T cells：LTB, IL7R, AQP3, IL32, ARID5B
• Monocytes：S100A8, S100A9, LYZ, S100A12, CST3
• Monocyte-derived DC cells： HLA-DQA1, HLA-DRB1, HLA-DRA, HLA-DPB1, HLA-DPA1
• NK cells： CCL4, GNLY, SPON2, NKG7, GZMB

图1C 显示了SLE、MS、pSS和HC组样本中每种细胞类型的百分比。这四组在B细胞、巨核细胞、单核细胞和增殖性T细胞方面存在显著差异（这是后续对这四种细胞类型分别进行疾病之间的差异比较的原因）；与HC组相比，MS组和pSS组的B细胞百分比较高，SLE组的B细胞百分比较低。与HC组相比，SLE、MS和pSS组的单核细胞百分比高于HC组。此外，增殖T细胞的百分比在SLE和pSS组中高表达，而在MS组中低表达。

图2A为CD8 + T细胞典型标记物的特征图：

图2B展示了在CD8 + T细胞中前4个标记基因在各个细胞类型的表达分布：

图2C是鉴定每种细胞类型的前10个标记基因的标准化表达热图。每行为一个基因，每列为一个单细胞：

在MS、pSS、SLE、HC组之间每个细胞类型的差异基因和差异基因所富集的通路

差异表达基因

图3A-D分别为SLE组与其他三组(MS、pSS和HC组)在B细胞(A)、巨核细胞(B)、单核细胞(C)和增殖T细胞(D)中差异表达最多的2个基因的表达分布小提琴图。图3E韦恩图显示了SLE、MS、pSS和HC组有234个共同的差异表达基因。其他组的比较可以阅读原文和附件图表。

差异表达基因的富集通路

为了更好地了解与SLE、MS和pSS相关的疾病相关细胞的功能状态，以及可能影响它们的潜在分子因素，作者对SLE与其他三组(MS、pSS和HC组)之间的差异表达基因(DEGs)进行了GO分析。作者发现免疫系统过程、细胞组分的组织或生物起源、信号传导、生物调控、刺激反应、代谢过程、单器官过程、细胞过程等生物过程在B细胞、巨核细胞、单核细胞和增殖性T细胞中高度富集。记忆性CD4+ T细胞的GO分析揭示了预期的生物过程的富集，如细胞过程、代谢过程、单生物过程、对刺激的反应以及细胞成分的组织或生物发生（图4A）。

进一步，利用KEGG通路和蛋白-蛋白相互作用网络分析SLE组和其他三组的差异表达基因 （图4B-C）。其他组的比较可以阅读原文和附件图表。

SLE、MS、pSS和HC组单核细胞的细分亚群

根据早期的基因表达谱分析，自身免疫性疾病的单核细胞生长明显不同，因此作者对SLE、MS、pSS和HC组的单核细胞进行了无监督聚类分析，以剖析单核细胞的异质性。

在PBMCs中鉴定出6个不同的单核细胞亚群（图5A）：

图5B显示了SLE、MS、pSS和HC组中6个单核细胞亚群的比例。

图5C显示了六个单核细胞亚群中前10个标记基因的热图。

图5D是各单核细胞亚群中的GO富集结果。

图5E为SLE、MS、pSS、HC组各细胞类型比例比较。自身免疫性疾病组和HC组之间的第1类、第2类和第5类差异显著。

SLE、MS和pSS组免疫细胞间的细胞间通讯

根据文中的分析，非免疫细胞在其信号通路中优于免疫细胞，无论是在相互作用的净数量还是相互作用的强度方面，如图6A和6B所示。作者发现SLE组和HC组在ANNEXIN、BAFF、BAG、CD40、CXCL、FLT3、GALECTIN、IFN-II、IL-16、MIF、MK和OX40信号网络上存在明显差异。

对推断的MIF信号网络的网络中心性分析发现，HC组中巨核细胞、记忆性CD4+ T细胞、单核细胞来源的DC细胞、NKT细胞、初始CD4+ T细胞、浆细胞样DC细胞、增殖性T细胞和CD8+ T细胞在FLT3信号通路中表现出靶细胞(接收者)的特性。此外，单核细胞来源的DC细胞在SLE组中也表现出FLT3信号通路源细胞的特性（图6D）。

另一方面，HC组中NK细胞是IFN-II信号通路的优势源细胞(发送者)。相反，在SLE组中，增殖的T细胞代表IFN-II信号通路的主要来源细胞(发送者)，这表明这些细胞通过旁分泌和自分泌信号传导的形式起作用（图6C）。

与其他细胞类型相比，通过SLE组和HC组之间的MK信号通路，早期祖细胞和增殖T细胞之间存在很强的互连，如热图所示 (图7A-B) 。此外，如图7C-D所示，生长中的B细胞和单核细胞来源的DC细胞之间通过MIF信号通路存在相当大的连通性。网络中心性分析表明，早期祖细胞是影响HC组和SLE组之间MK信号通路通信的关键发送者和影响者。值得注意的是，单核细胞来源的DC细胞是HC组中接收者、中介者和影响者的主要类型。

然而，在SLE组中，增殖的B细胞是发送者、中介者和影响者细胞的主要类型，这表明在SLE组中，细胞间通信的信息传递者（gatekeeper）发生了改变 (图7E-F) 。

此外，CellChat被用于研究每个通路中的特定通信:一个关键主题是众多细胞类型和信号通路如何协同工作。分析了传入和传出的信号模式，发现了三种模式。作者发现SLE组和HC组在外向沟通模式上存在一些差异（图8A-B）。

在HC组中，外向通讯模式显示CD8+ T细胞，巨核细胞，记忆性CD4+ T细胞、NK细胞、NKT细胞、Naïve CD4+ T细胞和增殖性T细胞以模式2为特征。模式2代表多种途径，包括MIF、ANNEXIN、CXCL、PARs、FLT3和IFN-II途径。红细胞、巨噬细胞、单核细胞和单核细胞衍生的DC细胞以模式3为特征，代表了GALECTIN、ANNEXIN、BAFF和TNF等途径（图8A）。

然而，在SLE组中，外向通讯模式显示巨噬细胞、巨核细胞、单核细胞和单核细胞衍生的DC细胞以模式1为特征，代表多种途径，包括GALECTIN、ANNEXIN、BAFF、CXCL和OX40（图8B）。

传入的通信模式也显著不同（图8C-D）。SLE组特异性信号通路FLT3、CD40和BTLA的表达水平显著升高，而PARs和BAG的表达水平显著降低。此外，这些信号分子在单核细胞、记忆性CD4+ T细胞和增殖性B细胞中的细胞通讯在SLE组中显著增加。MS组BTLA、CCL、CD40明显升高，而ANNEXIN、IFN-II等信号通路明显降低。

小结

疾病选择

多发性硬化症 （MS）、原发性干燥综合征 （pSS） 和系统性红斑狼疮 （SLE） 具有许多共同的临床症状和血清学特征，所以作者在单细胞转录谱层面去分析这三组自身免疫性疾病中的异常基因表达模式和细胞状态。

控制变量

刚开始分析单细胞图谱时，没有区分各个疾病分组。后续在比较疾病时，为避免其他变量干扰，会固定一种细胞类型去进行比较。

差异基因分析的细胞类型的选择

为什么在研究结果的第二部分差异分析的研究中，MS、pSS、SLE、HC组之间只对B细胞、巨核细胞、单核细胞和增殖性T细胞这四种细胞类型的差异基因进行分析？因为在图1C中发现四组疾病只在这四种细胞类型中有显著差异。