单细胞+bulkRNA分析前列腺癌中巨噬细胞相关基因

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文章信息

英文标题：Comprehensive analysis of macrophage-related genes in prostate cancer by integrated analysis of single-cell and bulk RNA sequencing 期刊：Aging (Albany NY). 2024 Apr 24:16. 影响因子：2区5.2 DOI: 10.18632/aging.205727 研究领域：单细胞

文献概述

背景：前列腺癌(PCa)是西方国家男性中最普遍的肿瘤，近年来其发病率呈上升趋势，占新发肿瘤的27%。巨噬细胞在肿瘤微环境(TME)和免疫治疗中PCa中的作用目前在很大程度上尚未探索。 方法：公共scRNA-seq和bulkRNAseq数据。鉴定了巨噬细胞标记基因，并根据scRNA-seq分析描述了TAM与TME内其他细胞类型之间的细胞间通讯。通过bulkRNA-seq分析，使用WGCNA构建了巨噬细胞的共表达网络来识别巨噬细胞相关基因。然后鉴定出具有完全不同的预后、临床病理特征、免疫微环境和免疫治疗反应的巨噬细胞相关分子亚型。接下来建立了用于PCa预后预测的巨噬细胞相关风险特征(MRS) ，并在八个独立的PCa队列中验证了 MRS 的性能。同时还揭示了不同危险人群之间免疫浸润格局和免疫治疗的差异。 结果：NCF4是MRS中的枢纽基因，可能是PCa的潜在研究目标。

文献内容

1.数据来源

这项研究共纳入了10个前列腺癌(PCa)队列，包括一个scRNA-seq队列（GSE141445）和9个bulkRNA-seq队列。

2.巨噬细胞标记基因鉴定

GSE141445的scRNA-seq数据包含来自12个原发性PCa样本的102899个细胞。质控后保留25999个细胞用于进一步分析。选择前1500个高度可变的基因。PCA降维并选择p<0.05的20个主成分(PC)进行后续分析。t-SNE聚类为22个细胞亚群。

每个亚群内前5个标记基因相对表达的热图。6细胞群为巨噬细胞。

3.C6簇与其他簇之间的细胞通讯分析

使用CellChat分析了簇C6和其他簇之间的细胞通信。根据配体-受体相互作用的数量和强度，在22个细胞亚群内发现了高度的细胞间相关性。 评价：为了凑图而凑图啊简直（希望作者不要看到我，我就说说而已，我不反对的真的

C6簇通过配体-受体对影响其他簇；例如，C6簇主要通过MIF (CD74+CXCR4)和MIF-(CD74+CD44)影响C2和C20簇 。

4.通过WGCNA鉴定前列腺癌巨噬细胞浸润相关基因

在TCGA-PRAD队列数据集中，基因被分为15个模块；其中绿色模块包含880个基因，与巨噬细胞高度相关。在 CPGEA队列数据集中，基因分为16个模块，其中棕色模块包含4726个基因，与巨噬细胞高度相关。

在GSE70768队列数据集中，基因被分为17个模块，其中红色模块包含410个基因与巨噬细胞高度相关。 接下来将上述三个数据集中与巨噬细胞高度相关的模块中的这些基因与单细胞数据集中的巨噬细胞标记基因进行交叉，最终获得了65个与巨噬细胞高度相关的基因用于后续分析。

5.PCa 中巨噬细胞相关分子亚型的鉴定以及亚型之间免疫景观的表征

将TCGA-PRAD队列中的497名PCa患者分为两个不同的亚型，其中 263个样本属于巨噬细胞相关基因亚型1和巨噬细胞相关亚型2中的234个样本。根据3D PCA，65个巨噬细胞相关交叉基因可以很好地区分这两个亚型。C2亚型的预后较差。

热图显示所有65个巨噬细胞相关交叉基因在亚型2中均显著高表达，亚型2的高水平GS、ISUP 、病理性T期和病理性N期的比例显著较高。

这项研究的结果意味着65个巨噬细胞相关交叉基因可用于区分PCa的两种预后与临床病例特征完全不同的亚型。

GSVA是为了确定可以解释两种亚型之间差异的潜在机制。

几乎所有与肿瘤进展、细胞间通讯和免疫相关的通路包括JAK-STAT信号通路、ECM-受体相互作用、趋化因子信号通路和T细胞受体信号通路都在亚型2中显著富集，这可能是预后较差的原因。

为了进一步探讨两种亚型之间差异的内在原因，对两种亚型的时间和免疫相关通路的活性进行了比较。包括检查点、HLA和巨噬细胞在内的所有免疫功能在亚型2中都更加活跃。亚型2的所有免疫细胞(包括巨噬细胞)的浸润丰度相对更高。

7种免疫浸润算法都一致显示亚型2中免疫细胞浸润较多，包括巨噬细胞M1和M2 。所有常见的HLA基因在亚型2中均显著高表达 。免疫检查点基因包括B7H3 (CD276)、HAVCR2、CTLA4、TIGIT和PD-1 (PDCD1)在亚型2中高表达。

Estimate socre = Stromal score + Immune score 基质评分，免疫评分越高，预后越好。

使用ESTIMATE算法根据每个PCa样本的基因表达谱计算了基质、免疫和估计分数，结果表明所有这些分数在亚型2中均显著较高（这里不是矛盾了？）。 最后,利用从TCIA数据库下载的IPS文件来分析PCa患者对免疫治疗的反应，以确定巨噬细胞相关簇是否可以预测 ICI反应。亚群2中的IPS、IPS-CTLA4 评分、IPS-PD1阻滞剂评分和IPSCTLA4+PD1阻滞剂评分显著高于亚群1，提示免疫治疗可能对亚群2的PCa患者更有利。

6.巨噬细胞相关特征(MRS)的开发和验证

在C1和C2这两种亚型中差异分析共筛选出1390个显著DEG，其中上调基因1332个，下调基因58个。GO分析表明DEG主要富集与免疫和细胞间通讯相关的功能。KEGG主要富集细胞因子-细胞因子受体相互作用、趋化因子信号通路和细胞粘附分子。

单变量Cox回归分析筛选出171个与PCa PFS相关的DEG。接下来使用497名PCa患者的TCGA队列作为训练集，通过LASSO回归分析和10 倍交叉验证筛选出14个DEG作为最佳预后生物标志物。随后通过多元Cox回归分析生成具有最低AIC值的模型。最后由八个DEG组成的巨噬细胞相关特征，包括ADAMTS14、LCN2、SCARA5、SYT4、NCF4、CHST13、FEV和PAX1。

利用每个基因的系数计算风险评分：MRS =(0.5156 ADAMTS14表达) + (-0.1546 LCN2表达) +(-0.4346 SCARA5表达) + (0.1359 SYT4表达) +(0.4235 NCF4表达) + (0.6643 CHST13表达式) + (0.1348 FEV表达) + (0.2045 PAX1表达)。 随后评估了预后特征的预测价值。根据中位风险评分值，将训练集中的PCa患者分为高风险组和低风险组。与低风险组相比，高风险组的PFS显著较差。训练队列中1年、3年和5年的AUC分别为0.771、0.772和0.741。ROC曲线表明在预测PCa患者的PFS方面，风险评分明显优于其他临床病理变量。

此外还对八个独立数据集(CPGEA、DFKZ、MSKCC、GSE116918、GSE70768、GSE70769、GSE46602和GSE70770)进行了外部验证，以进一步验证模型稳健性。所有队列均显示高危组患者的PFS时间显著缩短，ROC曲线均证实该特征在这些数据集中具有良好的预测价值。

7.独立的预后分析和列线图建立

桑基图说明了巨噬细胞相关亚型、风险评分和预后之间的关系，其中疾病进展的患者主要来自高危组。（看右上角的紫色）

在TCGA-PRAD队列中发现风险评分与GS、ISUP、病理T分期和病理N分期之间存在显著相关性，这些特征的等级越高表明风险评分显著增加。

单变量和多变量Cox回归分析均证实MRS是PCa的独立预后因素。基于MRS的列线图对PCa患者具有良好的预后预测价值。

8.不同风险组之间的 GSEA

为了进一步了解高风险亚组病理分期和预后较差的潜在机制，进行GSEA以确定高风险组中最显著富集的KEGG通路。几个经典的细胞间通讯相关通路包括趋化因子信号通路、细胞因子-细胞因子受体相互作用和ECM-受体相互作用，以及肿瘤相关通路包括NF-kappa B、PI3K-Akt和细胞周期在高风险组中富集。此外许多免疫相关通路也在高危组中富集，包括抗原加工和呈递、B细胞受体信号通路、T细胞受体信号通路和自然杀伤细胞介导的细胞毒性。这在一定程度上解释了高危组的病理分级明显较高且预后明显较差。

9.免疫景观

通过比较不同风险组中PCa免疫亚型比例，发现风险组之间免疫表型存在显著差异。高危组中，C2 (IFN-y为主）亚型和C4（淋巴细胞耗竭)亚型以及C3(炎症)亚型的比例显著降低。根据ssGSEA结果，高危组的免疫细胞(包括巨噬细胞)的浸润程度更高。风险评分与巨噬细胞、巨噬细胞M1和巨噬细胞M2的细胞含量呈正相关。

高危组具有更活跃的免疫功能，包括检查点、HLA和巨噬细胞。高危组中免疫检查点(包括CTLA4和PDCD1/PD-1)以及HLA高表达。高危组的基质评分、免疫评分和Estimate评分更高 。 通过TIDE算法测量，高危组的TIDE评分明显低于低危组，表明抗PD1/CTALA4治疗可能对高危患者更有益。

10.MRS核心基因NCF4的鉴定

使用"mgeneSim"功能将NCF4鉴定为MRS中的关键基因。然后探索了NCF4在单细胞数据集GSE141445的12个原发性前列腺癌样本中细胞类型中的表达。NCF4主要在巨噬细胞中表达，很少在其他细胞中表达。

在TIMER 2.0中进一步利用多种算法来检查免疫细胞浸润与NCF4表达之间的关系。结果表明，巨噬细胞、巨噬细胞M1和巨噬细胞M2与NCF4表达呈显著正相关。

在TCGA-PRAD队列和CPGEA队列中，NCF4在正常组织中的表达显著高于肿瘤组织。NCF4高表达组患者的预后较差。

总结

1. 考虑到PCa TME中的大多数免疫细胞是TAM，靶向TAMs激活抗肿瘤免疫是PCa免疫治疗的新方向。Su等人的研究根据TAMs相关的表达水平将肝细胞癌(HCC)患者分为三种亚型(高、中和低表达类型)基因，其中高表达型患者肿瘤分级更高，生存率更低，TIDE评分更高。这表明TAMs相关基因高表达的HCC患者预后较差，也更容易发生免疫逃逸，证明了分子亚型在HCC免疫治疗和预后预测中的潜力。
2. 本研究将TAMs相关分子亚型与PCa预后信息相结合，构建了由8个基因(ADAMTS14、LCN2、SCARA5、 SYT4、 NCF4、CHST13、FEV、PAX1)组成的MRS。其中高危组PFS较差, 1年、3年、5年AUC分别为0.771、0.772和0.741，预测效果优于传统预测因子，高危组的免疫细胞浸润率更高，免疫相关分子表达率更高，TIDE评分更低，表明高危组患者的TIME表现出热肿瘤的表型，更有可能对免疫治疗产生反应。将NCF4确定为MRS的核心基因。NCF4主要在PCa组织内的巨噬细胞中表达，巨噬细胞在TME中的浸润程度与NCF4的表达呈显著正相关。NCF4高表达的PCa患者预后较差。
3. 本研究鉴定了PCa患者中TAM相关基因，建立并验证了预测PCa患者预后的MRS模型，具有较好的预测能力，并评估了MRS危险组间TIME和免疫治疗反应的差异。