转录组准备工作-2

生信技能树学习笔记

书接上回，转录组测序完成后会得到FASTQ文件。

如下图所示：

其中，_1和_2代表同一个样本的双端测序，一端一个文件。

在转录组分析中用到的命令

分析目录——目录管理

规律的存放文件有利于查找，追溯。

建立目录的具体代码：

# 进入到个人目录

cd ~

## 1.建立数据库目录：在数据库下建立参考基因组数据库，注意命名习惯：参考基因组版本信息

mkdir -p database/GRCh38.105

## 2.建立项目分析目录

mkdir project

cd project

mkdir Human-16-Asthma-Trans # 注意项目命名习惯：物种-样本数-疾病-分析流程

cd Human-16-Asthma-Trans #不要用中文命名

# 建立数据存放目录

mkdir -pdata/rawdata data/cleandata/trim_galore data/cleandata/fastp

# 建立比对目录

mkdir -p Mapping/Hisat2Mapping/Subjunc

# 建立定量目录

mkdir -p Expression/featureCountsExpression/Salmon

# 查看整个分析目录准备结构

tree

├── data

│ ├── cleandata

│ ├── trim_galore

│ └── fastp

│ └── rawdata

├── Expression

│ ├── featureCounts

│ └── Salmon

└── Mapping

├── Hisat2

└── Subjunc

接下来分析用到的数据

分析前需要了解测序背景：

测序长度？75bp

单端or双端测序？paired end

测序对象？polyA

在文章的实验方法部分

文章中的分析流程

步骤1

将文件放在自己上面设置好的文件夹中

cd $HOME/project/Human-16-Asthma-Trans/data/rawdata #进入文件夹中

ln -s /home/t_rna/data/airway/fastq_raw25000/*gz./ #将文件用软链的方式连接到文件夹下面

#用ls或ll查看目录下文件

用zless -S查看文件，-S代表不换行格式

fastq数据格式

高通量测序（如Illumina NovaSeq等测序平台）得到的原始图像数据文件，经碱基识别（Base Calling）分析转化为原始测序序列（Sequenced Reads），我们称之为Raw Data或Raw Reads，结果以FASTQ（简称为fq）文件格式存储，其中包含测序序列（Reads）的序列信息以及其对应的测序质量信息。测序样品中真实数据随机截取结果如下图：

FASTQ格式文件中每个Read由四行描述

• 第一行以“@”开头，随后为Illumina测序识别符（Sequence Identifiers）和描述文字（选择性部分）；

• 第二行是碱基序列；

• 第三行以“+”开头，随后为Illumina测序识别符（选择性部分）；

• 第四行是对应序列的测序质量的ASCII码。

第一行解释

第四行-碱基质量值

碱基质量值（Quality Score或Q-score）是碱基识别（Base Calling）出错的概率的整数映射。通常使用的碱基质量值Q公式[1]为：

Q=-10 * log10P

其中P为碱基识别出错的概率。下表给出了碱基质量值与碱基识别出错的概率的对应关系

碱基质量值越高表明碱基识别越可靠，准确度越高。比如，对于碱基质量值为Q20的碱基识别，100个碱基中有1个会识别出错，以此类。

70=Q+33

Q=37 所以识别精度大约为99.99%

查看文件

统计SRR1039510_1.fastq.gz文件中共有多少条reads？25000 pairs reads

zless SRR1039510_1.fastq.gz | grep '^@SRR' -c

方法二

zless SRR1039510_1.fastq.gz | paste - - - - | wc -l

方法三

zless SRR1039510_1.fastq.gz | sed -n '1~4p' | wc -l

输出SRR1039510_1.fastq.gz文件中所有的序列ID（即第一行）

方法一

zless SRR1039510_1.fastq.gz | sed -n '1~4p' | less -S

方法二

zless SRR1039510_1.fastq.gz | grep '^@SRR' | less -S

方法三

zless SRR1039510_1.fastq.gz | grep '^@SRR' | cut -f 1 | less -S

方法四

zless -S SRR1039510_1.fastq.gz |awk '{if(NR%4==1){print}}' |less -S

NR表示整除==1表示第一行