晚期非小细胞肺癌肿瘤异质性和微环境的单细胞分析

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题目：Single-cell profiling of tumor heterogeneity and the microenvironment in advanced non-small cell lung cancer 期刊：Nature Communication（IF:12） 日期：2021年5月 DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-021-22801-0

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肺癌是一种高度异质性的疾病。癌细胞和肿瘤微环境中的细胞共同决定了疾病的进展，以及对治疗的反应或逃避。作者为了绘制晚期非小细胞肺癌 (NSCLC) 中癌细胞的细胞类型特异性转录组图谱及其肿瘤微环境，通过单细胞 RNA 测序分析了来自 III/IV 期 NSCLC 患者的 42 个组织活检样本，呈现了晚期非小细胞肺癌的单细胞分辨率条件下的情况。除了先前早期肺癌单细胞研究中描述的细胞类型外，作者还识别了肿瘤中的罕见细胞类型，如滤泡树突细胞和 T 辅助 17 细胞。来自不同患者的肿瘤在细胞组成、染色体结构、发育轨迹、细胞间信号网络和表型优势方面表现出很大的异质性。作者的研究还揭示了肿瘤异质性与肿瘤相关中性粒细胞的相关性，有助于阐明它们在 NSCLC 中的功能。

样本信息

收集42名晚期（III/IV期）NSCLC的原发灶，癌症种类及是否吸烟等信息如图。

单细胞测序技术

微流控芯片（具体见原文）

分析细胞数量

经过多个质量控制和过滤步骤，总共分析了 90,406 个细胞的转录组。

主要单细胞分析结果

晚期NSCLC细胞图谱

左上图显示了鉴定出的细胞类型，包括癌细胞、髓系细胞、成纤维细胞、T细胞、B细胞、 中性粒细胞、肺泡细胞、上皮细胞、内皮细胞、肥大细胞以及滤泡树突状细胞。左下图显示不同患者的非肿瘤细胞倾向于聚类在一起，而癌细胞具有患者异质性。右边两张图显示了标志基因热图以及细胞亚群所占百分比。

肺鳞癌比肺腺癌具有更高的瘤间和瘤内异质性

42 名患者的CNA 谱显示出患者间和患者内的异质性（a）。对于肺腺癌（LUAD）患者，在 7 号和 8q 号染色体中发现了显著的臂水平插入，在 10 号染色体中发现了缺失。值得注意的是，具有已知驱动突变的肺腺癌在 1q 和 5p 臂中有额外的扩增。相比之下，肺鳞癌（LUSC）患者大多有 3q 插入和 5q 缺失。有趣的是，一些没有驱动突变的肺腺癌患者具有与肺鳞癌相似的 CNA 谱。尽管癌细胞转录组的表达谱和组成在很大程度上是患者特异性的，但一些患者的癌细胞比其他患者更相似（b）。在大多数情况下，来自肺腺癌和肺鳞癌患者的癌细胞分成不同的簇。超过一半的肺腺癌患者聚集为一组，而大多数肺鳞癌肿瘤形成患者特异性簇，表明 LUSC 的肿瘤间差异高于肺腺癌。大多数患者，尤其是肺腺癌患者，例如 P16、P20 和 P32，具有显性克隆，而在少数肺鳞癌（例如 P27 和 P37）中，恶性细胞扩散到多个簇中。

为了量化肿瘤内异质性，作者定义了基于 CNA 和基于表达的肿瘤内异质性评分，表示为 ITHCNA 和 ITHGEX。作者观察到肿瘤内不同程度的异质性。ITHCNA 和 ITHGEX 显示出中等相关性（图d），可能是由于非驱动基因组改变或微环境形成的肿瘤表型。作者进一步根据癌症类型和突变将患者分为三组：具有驱动突变的 LUAD 患者（n = 12），表示为 LUADm，无驱动突变的 LUAD 患者（n = 6），表示为 LUADn，以及无驱动突变的 LUSC 患者突变（n = 16），表示为 LUSCn。有趣的是，与 LUADm 患者相比，LUSCn 患者具有显着更高的 ITHCNA，而在 ITHGEX 方面没有统计学意义（e）。这一发现还表明，具有驱动突变的患者可能会受到基因组改变以外的表型影响。

肺上皮细胞的可塑性及其向恶性肿瘤细胞的发育轨迹

这一部分是拟时序分析。所有鉴定的肺泡细胞均表达2型肺泡细胞 (AT2) 的典型标志物 (CLDN18、SFTPA1、SFTPC)，但不表达1型肺泡细胞标志物 (CAV1、AGER)。进一步的聚类分析揭示了两个不同的 AT2 细胞簇，表示为 AT2-1和AT2-2（a）。AT2-2类似于正常的 AT2 表型，具有常见的 AT2 标记 SFTPA 和转运蛋白 ABCA3 上调（b）。相比之下，AT2-1 表达细胞增殖和细胞迁移相关基因，如 CEACAM6、KITLG 和 FOXC1，暗示向恶性肿瘤的表型变化。上皮细胞可进一步分为纤毛上皮细胞、棒状细胞和基底细胞（c、d）。

以前的研究表明，AT2 细胞和club细胞都可以发育成 LUAD 细胞，而基底细胞和club细胞是 LUSC的潜在祖细胞。因此，作者根据它们的发育轨迹组织了 AT2 细胞、俱乐部club细胞和 LUAD 癌细胞（e）。推断的拟时间路径显示 AT2 细胞和club细胞独立地转变为 LUAD 肿瘤。相比之下，基底细胞似乎充当棒状细胞和 LUSC 肿瘤细胞之间的过渡状态（f）。除了这些不同的特征外，我们发现一些患者的肿瘤细胞在分支的末端紧密聚集，这意味着同质和终末表型，而其他患者则具有更多样和异质的特征，沿着癌症发展轨迹扩散。

Th17 样细胞及其与 Tregs 的潜在互变

在肿瘤浸润性T细胞中，作者鉴定到了 CD4+ naïve T cells, CD4+ Tregs, CD4+ T helper 17-like T cells (Th17-like), CD8+ effector T cells, CD8+ exhausted T cells, 和Natural Killer (NK) cells （a），T细胞亚型通过基于先前研究的 T 亚型表达谱的监督细胞类型注释确认（a）。为了进一步表征两个 NK 簇（CD3D-、KLRD1+、NKG7+），作者将 CD16+（FCGR3A）簇称为 NK-1，将 CD16-簇称为 NK-2（图 4b）。NK-1 包含编码上调的转录本fractalkine 受体 (CX3CR1) 和成纤维细胞生长因子结合蛋白 2 (FGFBP2)，两者都参与淋巴细胞的细胞毒功能。NK-2 具有更高的组织驻留标志物表达，如 CD49a (ITGA1)、CD103 (ITGAE) 和 ZNF683。包括 CTLA4 和 TIGIT 在内的共抑制免疫检查点富含 CD4+ Treg 和 CD8+ 耗尽的 T 细胞（c）。然而，LAG3 主要在 CD8+ 耗竭的 T 细胞中表达，这与之前的研究结果一致。

然后，作者使用 Slingshot18 和 Monocle19 对 CD4+ T 细胞进行轨迹分析，以确定它们在 TME 内的发育途径。Slingshot 揭示了 Tregs 和 Th17 样细胞之间的过渡关系，起源于幼稚细胞（d）。Monocle 发现，幼稚细胞分化为两个主要分支，Tregs 和增殖群体（e，f）。有趣的是，通过其主转录因子 RORC 的表达证实的 Th17 样细胞显示出沿从幼稚细胞到 Treg 的发育途径传播的过渡表型（f）。作者介绍，以 KLRB120 基因高表达为标志的 CD4+ Th17 样细胞群是通过 scRNA-seq 在 NSCLC 肿瘤环境中鉴定出的 Th17 样细胞的第一份报告。文献中有报道，天然 Tregs (nTregs)，Tregs 的一个子集，被认为与 Th17 样细胞相互转化。这一结果揭示了 Tregs 和 Th17 样细胞之间复杂而微妙的相互作用，并强调了它们在对肿瘤抗原的适应性免疫反应中平衡的重要性。