什么，你想要的单细胞亚群比例太少了？

本专辑将会系统性介绍单细胞图谱研究的标准数据分析思路，前面提到了：肿瘤样品的单细胞需要提取上皮细胞继续细分，眼尖的小伙伴们发现了一个问题， 就是它这个肝癌数据集里面的fibroblasts等细胞亚群占比非常少，如果真的要每个细胞亚群都继续细分， 对比例少的细胞分析起来会有误差。

我们再回顾一下这个发表于2020的文章，标题 是：《Single-cell transcriptomic architecture and intercellular crosstalk of human intrahepatic cholangiocarcinoma》，数据集在；https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE138709

文章里面确实提到了：The 498 fibroblasts in our unselected viable strategy of scRNA-seq analyses (Dataset 1) accounted for only 1.59% of all viable cells：

第一层次降维聚类分群

这个文章直接展示了第二层次分群，一般来说背诵下面的基因即可：

# T Cells (CD3D, CD3E, CD8A), 
# B cells (CD19, CD79A, MS4A1 [CD20]), 
# Plasma cells (IGHG1, MZB1, SDC1, CD79A), 
# Monocytes and macrophages (CD68, CD163, CD14),
# NK Cells (FGFBP2, FCG3RA, CX3CR1),  
# Photoreceptor cells (RCVRN), 
# Fibroblasts (FGF7, MME), 
# Endothelial cells (PECAM1, VWF). 
# epi or tumor (EPCAM, KRT19, PROM1, ALDH1A1, CD24).
#   immune (CD45+,PTPRC), epithelial/cancer (EpCAM+,EPCAM), 
# stromal (CD10+,MME,fibo or CD31+,PECAM1,endo) 

library(ggplot2) 
genes_to_check = c('PTPRC', 'CD3D', 'CD3E', 'CD4','CD8A',
                   'CD19', 'CD79A', 'MS4A1' ,
                   'IGHG1', 'MZB1', 'SDC1',
                   'CD68', 'CD163', 'CD14', 
                   'TPSAB1' , 'TPSB2',  # mast cells,
                   'RCVRN','FPR1' , 'ITGAM' ,
                   'C1QA',  'C1QB',  # mac
                   'S100A9', 'S100A8', 'MMP19',# monocyte
                   'LAMP3', 'IDO1','IDO2',## DC3 
                   'CD1E','CD1C', # DC2
                   'KLRB1','NCR1', # NK 
                   'FGF7','MME', 'ACTA2', ## fibo 
                   'DCN', 'LUM',  'GSN' , ## mouse PDAC fibo 
                   'Amy1' , 'Amy2a2', # Acinar_cells
                   'PECAM1', 'VWF',  ## endo 
                   'EPCAM' , 'KRT19', 'PROM1', 'ALDH1A1' )

单细胞转录组数据分析的标准降维聚类分群，并且进行生物学注释后的结果。可以参考前面的例子：人人都能学会的单细胞聚类分群注释 ，我们演示了第一层次的分群。

如果你对单细胞数据分析还没有基础认知，可以看基础10讲：

• 01. 上游分析流程
• 02.课题多少个样品，测序数据量如何
• 03. 过滤不合格细胞和基因（数据质控很重要）
• 04. 过滤线粒体核糖体基因
• 05. 去除细胞效应和基因效应
• 06.单细胞转录组数据的降维聚类分群
• 07.单细胞转录组数据处理之细胞亚群注释
• 08.把拿到的亚群进行更细致的分群
• 09.单细胞转录组数据处理之细胞亚群比例比较

Cancer-associated fibroblasts (CAFs) 细胞比例太少了

可以看到，就这么一点Cancer-associated fibroblasts (CAFs) ，但是它又是我们的研究目标！

而且目前呢，学界对CAFs的来源本来就是并不那么清晰，理论上不可能存的单一的标记基因来区分出来CAFs。通常CAFs有4种来源：

• The primary source is normal local fibroblasts, which are activated by stimuli from the tumor microenvironment.
• Mesenchymal stem cells (MSCs) and other mesenchymal precursor cells are other sources.
• Endothelial cells and epithelial cells do not belong to the fibroblast lineage, but they could transdifferentiate into CAFs-state cells.
• Finally, a self-renewable CAFs-stem cell population might exist in the hierarchical organization, and these cells share similar characteristics as MSCs.

如果要筛选CAFs，首先要去除4个基因表达量为阳性的细胞亚群 ：

• CD31 (an endothelial marker)
• CD45 (a hematopoietic cell marker),
• desmin (a smooth muscle cell marker),
• EPCAM (epithelial cell adhesion molecule, an epithelial cell marker).

重新设计实验，如下所示，这样CAFs就勉强变多啦：

重新设计实验

众所周知，目前单细胞样品费用还居高不下，一个10x的建库加上测序起码两万五，如果做十几个甚至几十个才能获取到足够量的目标细胞亚群，就得不偿失了。那么，设计合理的实验策略来富集目标细胞就是一个很好的选择。

实验富集到的Cancer-associated fibroblasts (CAFs) 跟我们自己从单细胞数据集里面挑选的Cancer-associated fibroblasts (CAFs) ，后续分析是一模一样的。而且完全可以参考 ：肿瘤样品的单细胞需要提取上皮细胞继续细分，各个细分亚群找到特异性标记基因，特异性激活的基因集，特异性的转录因子等等。

因为10x单细胞转录组成本摆在那里，参考我们的《明码标价》专栏里面的单细胞内容

• 明码标价之10X技术单细胞（2.5万每个样品）（标准100G测序数据）
• 明码标价之10X转录组原始测序数据的cellranger流程（单个项目收费800起）
• 明码标价之单细胞转录组的质控降维聚类分群和生物学注释（单个项目收费800起）

仅仅是测数据每个样品就100G以上，对计算资源的消耗也很大。还等什么呢，赶快扫描下面二维码添加微信咨询吧！

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