前面提到了：肿瘤样品的单细胞需要提取上皮细胞继续细分，就是感兴趣的fibroblasts等细胞亚群占比非常少，所以研究者们做了第二次单细胞转录组数据，见：什么，你想要的单细胞亚群比例太少了？，其实这样的策略屡见不鲜。在小鼠模型里面也有：4T1这个TNBC小鼠肿瘤模型的CAFs异质性，其实大家并不能很好的确定自己研究的对象就是成纤维细胞。比如这个 肿瘤相关成纤维细胞异质性 就是分成了6群：

Subcluster 0 被作者定义为 vascular CAFs ，高表达 GJA4, and RGS5 等
Subcluster 1 被作者定义为 matrix CAFs ，高表达 LUM, DCN, and VCAN等
Subcluster 2 被作者定义为 inflammatory CAFs ，高表达 complement genes (C3 and C7). 等
Subcluster 3 被作者定义为 antigen-presenting CAFs ，高表达CD74, HLA- DRA, and HLA-DRB1 等
Subcluster 4 被作者定义为 EMT-like CAFs ，高表达 KRT19, KRT8 等
Subcluster 5 被作者定义为 lip- ofibroblast–c5–FABP1 ，高表达APOA2, FABP1, FABP4, and FRZB等

如果按照其它理论，会认为所谓的 vascular CAFs ，高表达 GJA4, and RGS5 等，其实是周细胞，而 EMT-like CAFs ，高表达 KRT19, KRT8 ，可能都不一定是一个真正的单细胞亚群。

这个时候多看不同的文献，进行归纳汇总，应该是一个比较好的策略。

比如2022年发表在《Theranostics》杂志的文章：《Single-cell RNA landscape of the osteoimmunology microenvironment in periodontitis》，首先进行第一层次降维聚类分群，得到了如下所示的10个亚群：

可以看到这个时候的所谓的 fibroblast细胞亚群首先占比并不多，给出来的标记基因就一个 COL1A1：

第一层次的 fibroblast细胞亚群

所以接下来作者把这 2194个fibroblast细胞提取出来，再次进行降维聚类分群，发现里面其实并不都是成纤维细胞，如下所示：

2194 fibroblasts (as in Figure 1A),

再次从里面拿到 1358 真正的 fibroblasts (cluster 1/2/3/5/8/9 in A), ，继续降维聚类分群，居然又是可以区分成为6个独立的亚群：

又是可以区分成为6个独立的亚群

值得注意的是其中有3个成纤维细胞亚群，给了全新的名字：

这个研究的重点就是关注这3个亚群，使用拟时序方法来看具体细节上的差异：

拟时序方法来看具体细节上的差异

是不是很有意思？

其实挺容易看懂的，如果你是现在才入坑单细胞的，可以先看看基础10讲：

最基础的往往是降维聚类分群，参考前面的例子：人人都能学会的单细胞聚类分群注释

你确定你研究的是成纤维细胞吗