王利新/周斌等合作构建遗传工具小鼠实现无性别差异标记平滑肌细胞

近日，Science China Life Sciences（《中国科学：生命科学（英文）》》杂志在线发表了复旦大学附属中山医院王利新教授团队与中国科学院分子细胞科学卓越创新中心（生物化学与细胞生物学研究所）周斌教授团队合作的研究成果“Smooth Muscle Cell-Specific Genetic Targeting by Myh11-driven Cre(ER) Knockin Mice”。该工作构建了一种无性别差异特异性标记平滑肌细胞的遗传示踪工具小鼠，突破了传统靶向平滑肌细胞转基因工具小鼠中具有伴性遗传（Y染色体）的局限性（只能在雄性小鼠中实现谱系示踪），为研究心血管系统稳态和疾病中平滑肌细胞命运转变提供了有效的遗传新工具。

平滑肌细胞（Smoothmuscle cell，SMC）是主动脉中膜的主要骨架细胞，其收缩功能是维持主动脉血管结构和功能的核心基础。正常生理情况下，分化成熟的SMC细胞形态细长呈纺锤形，具有较高的细胞特异性，高表达收缩型标志蛋白α-SMA、SM22α和SM-MHC（由Myh11编码）等。同时成熟的SMC表现为极低的增殖和合成功能，具有维持血管舒缩功能、调节血压和血流分布的作用。SMC具有强大的可塑性，在各种病理状态下，SMC发生去分化，合成型标志蛋白OPN等表达增多，细胞增殖、迁移能力增加，并获得间充质干细胞和巨噬细胞等的特征。

主动脉瘤（aorticaneurysm）是由于主动脉血管壁结构缺陷，导致血管病理性扩张，超过正常血管直径的50%，高血压和动脉粥样硬化是主动脉瘤主要的诱发因素。当主动脉扩张到一定程度，血管壁薄弱难以承受血流压力，主动脉瘤发生破裂导致死亡。血管SMC功能障碍与主动脉血管壁结构完整性破坏密切相关，血管SMC的丢失和表型转换是主动脉瘤的重要病理特征。既往研究表明转化生长因子β（TGF-β）信号通路相关基因的突变与遗传性结缔组织疾病（包括Loeys-Dietz和Marfan综合征）的动脉瘤形成有关。

目前能够特异性标记SMC且被广泛用于研究的工具小鼠是由Offermanns实验室2008年构建的Myh11-CreER-Off转基因小鼠，但是由于其基因插入的位点位于Y染色体上，只能用于标记雄鼠，无法对雌鼠进行研究分析。然而临床上女性心血管疾病的发病率低于男性，因此以雄鼠为研究对象获得的实验结果不一定能在雌鼠上得到验证，缺乏普适性。

Myh11-Cre(ER)基因敲入小鼠特异性靶向平滑肌细胞用于心血管疾病研究

A. Myh11-Cre遗传示踪小鼠的实验策略。B. Myh11-Cre小鼠主动脉ZsGreen和Myh11免疫染色。C. Myh11-CreER遗传示踪小鼠的实验策略。D. 腹主动脉瘤小鼠模型构建实验设计示意图。E. Samd4突变小鼠Myh11-CreER;Smad4flox/flox; R26-tdT和对照小鼠Myh11-CreER; Smad4flox/+;R26-tdT（包括雌性和雄性小鼠）的主动脉的明场场和荧光图。F. 主动脉切片tdT、αSMA、SMAD4免疫染色。

研究人员首先利用CRISPR/Cas9技术将Cre 重组酶cDNA插入到小鼠Myh11基因位点的内源性ATG中，并与响应Cre的报告小鼠（Rosa26-loxP-Stop-loxP-ZsGreen）杂交，使得Myh11+SMCs永久表达ZsGreen。通过免疫荧光染色验证雄性和雌性小鼠Myh11+ SMCs均可表达ZsGreen。进一步在小鼠Myh11基因位点的内源性ATG中插入CreERT2cDNA构建他莫昔芬诱导型My11-CreER小鼠，并于Rosa26-loxP-Stop-loxP-tdTomato（R26-tdT）报告小鼠杂交，同样实现了对雄性和雌性小鼠Myh11+ SMCs的成功标记。最后，利用该工具小鼠研究主动脉SMC中Smad4基因表达在主动脉瘤形成中的作用，构建Myh11-CreER;Smad4flox/flox;R26-tdT突变小鼠，敲除SMCs中的Smad4基因，并Myh11-CreER;Smad4flox/+;R26-tdT为对照组，观察SMC中Smad4敲除对不同性别小鼠主动脉瘤的形成的影响。

综上，研究团队通过基因敲入技术构建了一种新的遗传工具小鼠Myh11-Cre（ER），用于标记不同性别小鼠的SMC，为研究SMC在稳态及疾病发生时结构功能变化的性别差异提供有力的实验工具。